Dokument 2.pdf - OPUS-Datenbank - Universität Hohenheim

4 Material und Methoden
die in einem Experiment zu analysierenden Proben wenn möglich auf einem Gel aufgetrennt.
Pro Zustand wurden sowohl in dem Membranprotein-Experiment als auch in der
1D-Gel-Fraktionierung des gesamten Zellextraktes drei biologische Replikate analysiert.
Die beiden Ansätze sind in Abbildung 4.1 exemplarisch gegenübergestellt.
4.4.2 Proteinfärbung
4.4.2.1 Coomassie-Färbung
Bei der in dieser Arbeit verwendeten Coomassie-Färbung, handelt es sich um eine kolloidale
Coomassie Färbung (G250), welche mit der anschließenden massenspektrometrischen
Analyse kompatibel war. Da die Sensitivität der Färbung keine entscheidende
Bedeutung für die weitere Analyse der Membranfraktion und des Gesamtproteoms hatte,
wurde diese Färbemethode der aufwendigeren Silberfärbung in diesen Fällen vorgezogen.
Die Färbelösung wurde nach Angaben des Herstellers (Carl Roth, Deutschland)
hergestellt. Hierzu wurden 60 ml H 2 O mit 20 ml Methanol und 20 ml Roti TM -Blue gemischt
und das 1D-Gel darin für mehrere Stunden inkubiert. Die Entfärbung erfolgte
durch H 2 O in einem neuen Gefäß. Zur Dokumentation wurden die Gele anschließend
auf einem Typhoon Trio-plus Scanner bei einer Anregungswellenlänge von 633 nm ohne
Emissionsfilter gescannt.
4.4.2.2 Silberfärbung
Diese Färbung wurde vor allem zur Kontrolle der 2D-DIGE-Gele eingesetzt (s. Abschnitt
4.4.3.6). In einem ersten Schritt wurden die Gele über Nacht unter leichtem
Schütteln in 30% Ethanol und 10% Essigsäure fixiert. Nach viermaligem Wachen mit
H 2 O für je 10 min wurden die Gele mit 8 mM Natriumthiosulfat für 5 min sensibilisiert
und erneut zweimal mit H 2 O für je 2 min gewaschen. Die Färbung erfolgte mit
10 mM Silbernitrat für eine Stunde. Im Anschluss an die Färbung wurden die Gele in
eine neue Glaswanne überführt, gewaschen (H 2 O für 30 s) und mit Entwicklerlösung
für 20 bis 30 min entwickelt. Sobald eine ausreichend intensive Färbung der Protein-
Spots zu erkennen war, wurde die Entwicklerlösung entfernt und die Reaktion gestoppt
(Stopplösung). Pro Gel wurden 500 ml jeder Lösung eingesetzt.
4.4.3 2D-DIGE
Die durchgeführten 2D-DIGE-Analysen gliederten sich in mehrere Schritte, die im Folgenden
separat besprochen werden.
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