Dokument 2.pdf - OPUS-Datenbank - Universität Hohenheim

4.6 Quantifizierung der Metabolite des Vanillinstoffwechsels
nach der erwarteten Retentionszeit). Da Dwell- und Cycle-Time von der Zahl der in
den einzelnen „Fenstern“ überwachten SRM-Übergängen abhängen, können diese hier
nicht verlässlich angegeben werden. Es wurde der in Tabelle 4.14 angegebene Gradient
verwendet. Q1 und Q3 wurden mit „Unit Resolution“ betrieben.
Die Peakflächen der erhaltenen Übergänge wurden mit der Software MultiQuant berechnet
und im Anschluss statistisch ausgewertet. Wie bei den vorherigen Versuchen
wurden auch im Rahmen dieses Experiments drei biologische Replikate je Zustand analysiert.
Um technische Varianzen zwischen den einzelnen Proben und LC-MS-Läufen
auszugleichen, wurde ein Referenzlauf bestimmt und die übrigen Analysen auf diesen
normalisiert. Hierzu wurden die Peakflächen der Referenz-Proteine für die Berechnung
eines Korrekturfaktors herangezogen.
In einem ersten Schritt wurde das Verhältnis der Peakflächen von fünf SRM-Übergängen
aus zwei unterschiedlichen Referenz-Proteinen zwischen dem zu normalisierenden und
dem Referenz-Lauf gebildet. Im Anschluss wurden die Peakflächen dieser Übergänge
aufsummiert und das arithmetische Mittel bestimmt. Dieser Wert stellte den Korrekturfaktor,
welcher zur Normalisierung verwendet wurde, dar. Nach erfolgter Normalisierung
wurden für jeden SRM-Übergang die Peakflächen eines Zustandes (z.B. Glucose)
aufsummiert und das arithmetische Mittel dieser Peakflächen bestimmt. Aus dem Vergleich
der beiden Zustände wurde dann die Regulation der einzelnen SRM-Übergänge
berechnet. Um berücksichtigt zu werden, musste ein Übergang in mindestens zwei Läufen
pro Zustand detektiert werden oder in einem Zustand geschlossen nicht auftreten.
Die Regulation eines Proteins wurde aus den Regulationsfaktoren der zu diesem Protein
gehörenden SRM-Übergänge bestimmt (Mittelwert). Konnten für ein Protein weniger
als drei proteotypische Peptide oder für ein Peptid weniger als drei SRM-Übergänge
identifiziert werden, wurde die Analyse mit der maximalen Anzahl identifizierter SRM-
Übergänge durchgeführt.
4.6 Quantifizierung der Metabolite des
Vanillinstoffwechsels
Die für die Quantifizierung benötigten Proben wurden wie in Abschnitt 4.2.3.3 beschrieben
kultiviert. Nach Inokulation der Hauptkultur wurde alle zwei Stunden 1 ml
der Kultur entnommen und bei 100.000 g für 30 min zentrifugiert. Im Anschluss wurde
der Überstand steril filtriert (0,2 µm Filter) und bis zur Analyse bei 4 ◦ C gelagert.
Für die Analyse wurden die Proben 1/100 verdünnet und 5 µl auf einer RP-C18-
HPLC-Säule (50 x 2,1 mm, 2,6 µm, 100 Å, Phenomenex-Kinetex) bei einer Flussrate
von 200 µl/min bei 40 ◦ C mit dem in Tabelle 4.15 beschriebenen HPLC-Gradienten auf-
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