Dokument 2.pdf - OPUS-Datenbank - Universität Hohenheim

4 Material und Methoden
Quotienten der Mittelwerte der Spotvolumina zwischen den untersuchten Zuständen
bestimmt. Zudem kalkulierte die Software für jede Regulation mit Hilfe einer Varianzanalyse
(One Way ANOVA) einen p-Wert und lieferte damit ein Maß für die Signifikanz
der Regulation. Als Kriterien für einen differentiell regulierten Spot wurden in dieser
Arbeit ein p-Wert < 0,05 und eine Regulation ≥ 1,8 festgelegt. Diese Schwellenwerte
waren zuvor bei einem Vergleich identischer Proben durch 2D-DIGE empirisch ermittelt
worden (Daten nicht gezeigt). Alle signifikant regulierten Spots wurden nach der statistischen
Auswertung zusätzlich manuell überprüft, da die in der Software implementierte
Filterfunktion nicht alle Artefakte (Farbstoffe, Staub, etc.) erfasste und schwache Spots,
welche massenspektrometrisch nicht oder nur schwer identifiziert werden können, von
der Analyse ausgeschlossen werden sollten. Dies führte in einigen Experimenten zu einer
deutlichen Reduktion der zu analysierenden Spots. Die Positionen regulierter Spots
wurden anschließend als Liste aus der Software exportiert und in die Software des
Ettan TM Spot Pickers importiert.
4.4.3.6 Spot Picking
Im Anschluss an die Auswertung wurden die Gele in den Ettan TM Spot Picker überführt
und die regulierten Spots anhand der importierten Liste automatisch ausgestochen.
Dabei wurde diejenigen Gele verwendet, welche mit Bind Silane behandelt und
mit Marker-Punkten versehen worden waren. Die aus den immobilisierten Gele ausgestochenen
Protein-Spots wurden in 96-well Platten überführt und für die massenspektrometrische
Analyse verdaut (s. Abschnitt 4.5.1). Da das Ausstechen der regulierten
Protein-Spots auf Basis der Fluoreszenz-Bilder automatisch erfolgte, wurde die Präzision
des Roboters im Anschluss mittels Silberfärbung überprüft. Hierbei fiel auf, dass
das Eigengewicht der Cy-Farbstoffe (wie in der Einleitung beschrieben) besonders im
niederen Molekulargewichtsbereich (10-25 kDa) zu einer Auftrennung von markierten
und nicht markierten Proteinen führte. Da nur die Position der mit Cy-Farbstoffen
markierten Protein-Spots durch den Roboter erfasst wurden und nur etwa 3% der Proteine
eines Spots markiert waren, enthielten die ausgestochenen Proben häufig zu wenig
Protein für eine Identifizierung mittels LC-ESI-MS/MS. Daher wurden im Anschluss an
die Silberfärbung (s. Abschnitt 4.4.2.2) Protein-Spots, welche durch den Roboter nicht
korrekt erfasst wurden, manuell ausgestochen. Hierdurch konnte die Zahl der identifizierten
Proteine im niederen Molekulargewichtsbereich (10-25 kDa) deutlich gesteigert
werden.
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