Dokument 2.pdf - OPUS-Datenbank - Universität Hohenheim

5 Ergebnisse
Differenzielle Regulation von Proteinen in Pseudomonas putida JM37 nach Behandlung
mit Glyoxylsäure (GXS)
Unter den 2D-DIGE-Experimenten war in diesem Versuch die größte Zahl differentiell
regulierter Spots zu finden. So waren insgesamt 134 Spots nach statistischen Kriterien
differentiell reguliert, wovon 34 Spots nach manueller Evaluierung für die massenspektrometrische
Analyse ausgewählt wurden. Hiervon waren 30 Spots nach der Behandlung
mit GXS verstärkt, vier vermindert exprimiert.
In den mit GXS behandelten Zellen zeigten die Enzyme Malat-Synthase (17-fach) und
Glyoxylat-Carboligase (16-fach) die stärkste Induktion. Eine Regulation der Isocitrat-
Lyase über den definierten Schwellenwert (1,8-fach) konnte nicht festgestellt werden.
Wie bereits bei EG behandelten Zellen, war auch nach GXS-Behandlung das Enzym
Hydoxypyruvat-Isomerase (12-fach) reguliert. Die zusätzliche Regulation der Hydroxypyruvat-Reduktase
deutet auf einen Abbau von Glyoxylsäure über Hydroxypyruvat zu
Glycerat hin. Das Enzym Hydroxy-Oxopropionate-Reduktase, welches die Umwandlung
von Tatronat-Semialdehyd zu Glycerate katalysiert, konnte jedoch nicht identifiziert
werden (Abbildung 5.7). Einen weiteren Hinweis auf die Induktion des „Glycerat-
Pathways“ liefert die Induktion der Pyruvat-Kinase. Darüber hinaus legt die Induktion
der Malat-Dehydrogenase eine Regulation des „Glyoxylatzyklus“ (bzw. „Dicarboxylic-
Acid-Cycle“) nahe. Wie bereits bei P. putida KT2440 beobachtet, kommt es auch bei
P. putida JM37 nach GXS-Behandlung zu einer Induktion von AcsA jedoch nicht zu
einer Induktion von PedR1.
5.1.2 Analyse des Membranproteoms
Zusätzlich zu den im vorherigen Abschnitt beschriebenen 2D-DIGE-Experimenten wurde
auch das Membranpellet, welches neben der zytosolischen Fraktion während der
Probenvorbereitung gewonnen wurde, auf differenziell regulierte Proteine untersucht.
Da 2D-DIGE nicht die Methode der Wahl zur Analyse von Membranproteinen darstellt,
wurde zur Quantifizierung dieser Fraktion ein labelfreier massenspektrometrischer
Ansatz gewählt. Dabei kam aufgrund der Komplexität der Probe ein 240 min
UPLC-Gradient zum Einsatz. Neben den beiden Wildtypen P. putida KT2440 und
JM37 wurde auch die Mutante P. putida GN259 mit dieser Methode untersucht. Da
von der Mutante P. putida GN187 keine zusätzlichen Informationen erwartet wurden
(es wurde vermutet, dass der Abbau von EG in KT2440 ohnehin nur über AceA erfolgt),
wurde GN187 in dieser Analyse nicht berücksichtigt.
82