Dokument 2.pdf - OPUS-Datenbank - Universität Hohenheim

3.3 Massenspektrometrie und quantitative Proteomanalyse
beteiligte, Enzyme zu identifizieren und die Eignung von Pseudomonas aeruginosa zur
Synthese von zyklischen Terpenoiden zu evaluieren, wurden im Rahmen dieses Teilprojektes
unterschiedliche Proteomanalysen durchgeführt. Neben dem Abbau von Citronellol
und Citronellsäure wurde auch der Abbau von Oktansäure als Beispiel für einen
nicht-methylierten Kohlenwasserstoff untersucht.
3.3 Massenspektrometrie und quantitative
Proteomanalyse
3.3.1 Reversed Phase-HPLC und Massenspektrometrie
Wie bereits in Abschnitt 3.1.3 beschrieben, war und ist die Massenspektrometrie eine
zentrale Technologie der modernen Proteomforschung und Systembiologie. Im Gegensatz
zu immunologischen Detektionsmethoden ermöglicht sie eine kostengünstige und
schnelle Identifizierung von Proteinen, deren Sequenz aus Genom-Sequenzierungsprojekten
bekannt ist. Für unbekannte Proteine stellt sie in vielen Fällen eine schnelle und
robuste Alternative zur N-terminalen Sequenzierung (Edman-Abbau)(Edman, 1949)
dar. Dabei hat sich mit der Weiterentwicklung des Forschungsfeldes der Fokus vom
einzelnen biologisch relevanten Protein, hin zur Gesamtheit aller Proteine verschoben.
Patterson et al. (2003) beschreiben dies als den so genannten „Reversen Ansatz“. Anstatt
von einem Phänotyp auf ein Protein oder Gen zu schließen, wird der entgegengesetzte
Weg, der von Gen- oder Proteininformationen auf den Phänotyp schließt, eingeschlagen.
Hierdurch kommt der Identifizierung und Quantifizierung einer großen Anzahl von
Proteinen aus komplexen Gemischen sowie der Charakterisierung verschiedener posttranslationaler
Modifikationen eine zentrale Bedeutung zu (s. Abschnitt 3.3.5). Bedingt
durch die hieraus resultierenden breiten Anforderungen an die Methodik, haben sich in
den letzten Jahren verschiedene Massenspektrometer für unterschiedliche Proteomics-
Anwendungen etabliert. Der grundlegende Aufbau sowie das Grundprinzip der Messung
sind jedoch für alle Geräte identisch. So besteht jedes Massenspektrometer aus einer
Ionenquelle, einem oder mehreren Massenanalysatoren sowie einem Detektor und liefert
als Ergebnis das Masse zu Ladungsverhältnis (m/z) des Analyten.
Obwohl es in jüngerer Zeit vermehrt Bestrebungen gibt, ganze Proteine massenspektrometrisch
zu analysieren (sog. „top-down“-Ansätze), weist dieser Ansatz noch einige
technische Limitierungen auf (Armirotti et al., 2010). So sind viele Massenanalysatoren
nur bedingt für die Analyse großer Moleküle (> 20.000 Da) geeignet oder zeigen
in diesem Bereich nur ein stark vermindertes Auflösungsvermögen. Auch die chromatographische
Trennung von Proteinen ist aufgrund ihrer Hydrophobizität und Größe
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