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1 Zusammenfassung Induktion der Fettsäurebiosynthese konnte hingegen nicht bestätigt werden. Im Rahmen der Proteomanalyse des Vanillin-Metabolismus in P. putida KT2440 konnte eine Induktion des β-Ketoadipat-Weges, über welchen Protocatechuat zu Succinylund Acetyl-CoA abgebaut wird, gezeigt werden. Zudem fanden sich deutliche Hinweise, dass das Enzym „Vanillin-Dehydrogenase“ für den initialen Schritt des Vanillin-Abbaus, der Umsetzung von Vanillin zu Vanillinsäure, in P. putida KT2440 nicht essentiell ist, sondern auch alternative Enzyme diese Reaktion katalysieren können. Als mögliche Kandidaten hierfür konnten die Enzyme Coniferylaldehyd-Dehydrogenase (PP_5120) und Benzaldehyd-Dehydrogenase (PP_1948) sowie weitere Aldehyd-Dehydrogenasen (PP_2680, PP_0545) identifiziert werden. Wie die verbesserte Akkumulation von Vanillin in den von Nadja Graf (AG Altenbuchner, Institut für Industrielle Genetik, <strong>Universität</strong> Stuttgart) auf Basis der Proteomdaten erzeugten P. putida KT2440-Mutanten zeigte (nicht veröffentlichte Ergebnisse, Graf und Altenbuchner), können diese Daten wertvolle Hinweise für die gezielte genetische Manipulation von Bakterien und damit für die Optimierung biotechnologischer Prozesse liefern. Zudem konnte gezeigt werden, dass neben den unspezifischen Efflux-Systemen TtgABC und MexE, MexF, OprN auch für Intermediate des Vanillin-Metabolismus spezifische Transporter wie PcaK/PcaP und PP_3739/PP_3740 beim Wachstum auf Vanillin induziert sind. Die Untersuchung des Terpenmetabolismus erfolgte im Gegensatz zu den übrigen in dieser Arbeit vorgestellten Analysen nicht in P. putida, sondern in P. aeruginosa, da nur dieser Organismus über die für den Terpenabbau nötige genetische Ausstattung verfügt. Im Rahmen der durchgeführten GeLCMSMS-Experimente wurde der Metabolismus des Terpens Citronellol dem der Oktansäure sowie dem von Glucose gegenübergestellt. Es konnte gezeigt werden, dass der Abbau von Citronellol über die durch das atu- und liu-Gencluster kodierten Enzyme sowie über die β-Oxidation der Fettsäuren verläuft. Dabei wurde einzig das Enzym „Very-long chain Acyl-CoA Synthetase“ (AtuH) nicht identifiziert. Die Proteomanalyse offenbarte jedoch eine Reihe möglicher alternativer unter Citronellol regulierter Acyl- und Acetyl-CoA-Synthetasen, welche diesen Schritt katalysieren könnten. Die Analyse verschiedener, der β-Oxidation zugeordneter Enzyme zeigte zudem, dass einige Enzyme möglicherweise eine Präferenz für Terpene (Citronellol) im Gegensatz zu unverzweigten Carbonsäuren (Oktansäure) aufweisen. Neben den quantitativen Proteomanalysen im Rahmen der biotechnologischen Teilprojekte, beinhaltete diese Arbeit auch die Etablierung von geeigneten Analysemethoden. So konnten insbesondere für die Quantifizierung von Membranproteinen und des Gesamtproteoms geeignete Methoden der Probenvorbereitung und Quantifizierung etabliert werden. Mit Hilfe einer Carbonatextraktion und anschließender labelfreier massenspektrometrischer Quantifizierung konnte eine Vielzahl von, in 2D-DIGE- Analysen nur schwer zu erfassenden, Membranproteinen identifiziert und quantifiziert 2
werden. Des Weiteren konnte für die Analyse des Gesamtproteoms ein GeLCMSMS- Ansatz, welcher die Identifizierung und Quantifizierung von etwa 30% aller in P. putida KT2440 kodierter Proteine erlaubt, etabliert werden. Verschiedene Methoden der Proteomanalyse können somit einen wertvollen Beitrag zur biotechnologischen Stammentwicklung und zum Verständnis zellulärer Netzwerke leisten. 3
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4 Material und Methoden SRM-Überga
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5 Ergebnisse Abbildung 5.1: Durchf
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5 Ergebnisse Differenzielle Regulat
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5 Ergebnisse Abbildung 5.6: Postuli
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5 Ergebnisse Abbildung 5.7: Unter G
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5 Ergebnisse 5.2 Untersuchungen zum
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5 Ergebnisse ausgesetzt. Grundlage
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5 Ergebnisse Locus-Tag Gen Protein
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5 Ergebnisse 5.3.1 Analyse der zyto
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5 Ergebnisse Tabelle 5.27: Übersic
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5 Ergebnisse Locus- Gen Protein Glu
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5 Ergebnisse Abbildung 5.41: Schema
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6 Diskussion in P. putida JM37 deut
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6 Diskussion al., 1995; Toyama et a
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6 Diskussion stoffquelle abhängig
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6 Diskussion 3 g/l Butanol könnte
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6 Diskussion cken sich dabei nicht
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6 Diskussion setzungsversuche von Y
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6 Diskussion mäßig geringen Grö
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6 Diskussion Publikation Verwendete
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6 Diskussion senspektrometrischer Q
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6 Diskussion Wie bereits in den üb
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Literatur Alban, Andrew, Stephen Ol
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Literatur Chattopadhyay, Ava, Karin
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Literatur bp inverted repeat sequen
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Literatur Inui, Masayuki, Masako Su
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Literatur Lovric, Josip (2011). Int
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Literatur comparative analysis of t
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Literatur coding three quinoprotein
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Literatur Schmidt, Alexander, Josef
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Literatur Toyama, Hirohide, Zhi-Wei
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Literatur Wood J. M., W. A. und R.
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Abkürzungsverzeichnis CE DC GeLCMS
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Eidesstattliche Versicherung Eidess
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Anhang Alle Tabellen und Abbildunge
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