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3 Einleitung
weiter zu erhöhen, ist die Verwendung einer „scheduled SRM“-Methode. Diese Methode
beruht auf der Tatsache, dass ein bestimmtes Peptid in einem definierten Zeitraum
von der RP-Säule eluiert und SRM-Übergänge, welche der Detektion dieses Peptides
dienen, nur während dieser Zeit zu erwarten sind. Somit ist es möglich, bestimmte
SRM-Übergänge nur während eines definierten Zeitfensters und nicht während des gesamten
Gradienten zu „scannen“. Dies reduziert die Cycle-Time drastisch und erlaubt
durch die Erhöhung der Dwell-Time einen deutlichen Sensitivitätsgewinn (Stahl-Zeng
et al., 2007).
3.4 Zielsetzung
Ziel dieser Arbeit ist es, im Rahmen des Verbundprojekts „Systembiologie in Pseudomonas
putida für die industrielle Biokatalyse“, quantitative Veränderungen des Proteoms
von Pseudomonas putida KT2440 in Gegenwart verschiedener Substanzen, welche
Edukte bzw. Produkte möglicher biotechnologischer Synthesewege darstellen, zu
analysieren. Dabei sollen die Auswirkungen der Stoffe Ethylenglycol, Glyoxylsäure,
Butanol und Vanillin auf P. putida KT2440 untersucht werden. Eine weitere Analyse
zum Metabolismus von Terpenen (Citronellol) soll in P. aeruginosa PAO1 erfolgen,
da dieser Organismus, im Gegensatz zu P. putida KT2440, über die nötige genetische
Ausstattung verfügt. Ein besonderes Augenmerk liegt bei allen Analysen auf Enzymen,
welche für den Abbau der gewünschten Produkte verantwortlich bzw. an der Synthese
wirtschaftlich interessanter Zwischen- und Endprodukte beteiligt sind. Zudem sollen
Toleranzmechanismen sowie eine mögliche Stressantwort gegenüber den eingesetzten,
teilweise toxischen, Substanzen analysiert werden.
Im Kontext des Verbundprojekts sollen die erhobenen Proteomdaten durch die Identifizierung
von Schlüsselenzymen konkrete Anhaltspunkte für die Entwicklung von Pseudomonas-Mutanten
liefern, welche die gewünschten Produkte (Glyoxylsäure, Vanillin,
Butanol) synthetisieren und akkumulieren. Diese von den Projektpartnern generierten
Mutanten sollen im Anschluss ebenfalls auf quantitative Veränderungen des Proteoms
untersucht werden, um Veränderungen im Stoffwechsel aufzuzeigen und mögliche
Schritte zur weiteren Optimierung zu identifizieren. Darüber hinaus sollen die erhobenen
Proteomdaten zusammen mit Daten aus Transkriptom- und Metabolomanalysen
in ein genombasiertes Netzwerkmodell einfließen und zur Simulation des bakteriellen
Stoffwechsels herangezogen werden.
Für die Quantifizierung zytosolischer Proteine soll die bereits etablierte 2D-DIGE-
Methode verwendet werden. Da insbesondere große und hydrophobe Proteine mit dieser
Methode nur schwer zu erfassen sind, sollen vor allem für die quantitative Untersuchung
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