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4 Material und Methoden
in ein neues Reaktionsgefäß überführt und das Pellet verworfen. Die Bestimmung des
Proteingehalts erfolgte mittels Bradford-Assay (s. Abschnitt 4.3.5).
4.3.4 Probenvorbereitung der 1D-Gel-Fraktionierungsproben
Die in 2 x Ladepuffer aufgeschlossene Probe (s. Abschnitt 4.3.1) wurde für 3 min auf
95 ◦ C erhitzt und im Anschluss bei 16.000 g für 10 min bei 4 ◦ C zentrifugiert. Aufgrund
der hohen Viskosität der Probe bildete sich häufig kein Pellet, weshalb die Probe
für 20 min im Ultraschallbad behandelt wurde. Die anschließenden Zentrifugation bei
16.000 g für 20 min bei 4 ◦ C führte zur Bildung des gewünschten Pellets. Der Überstand
wurde abgenommen, in ein neues Reaktionsgefäß überführt und der Proteingehalt mittels
Bradford-Assay (s. Abschnitt 4.3.5) bestimmt. Die Vorbereitung der Proben für die
Analyse des Terpen-Metabolismus unterschied sich von dem hier beschrieben Vorgehen
und ist in der Diplomarbeit von Nadine Walter (Walter, 2012) ausführlich beschrieben.
4.3.5 Bestimmung des Proteingehalts nach Bradford
Der Proteingehalt aller Proben wurde mittels Bradford-Assay bestimmt (Bradford,
1976). Vor der Analyse wurden die Proben 1:1000 verdünnt. Dies diente sowohl der
Anpassung der Proteinmenge an die zuvor erstellt Kalibriergerade (0 – 20 µg/ml BSA)
als auch der Verdünnung von in der Probe enthaltenen störenden Substanzen (SDS, Salze,
etc.). Für die eigentliche Messung wurden 800 µl der verdünnten Probe mit 200 µl
Bradford-Reagenz (Roti TM -Quant, Carl Roth) gemischt und 10 min bei Raumtemperatur
inkubiert. Daraufhin wurde die Probe bei 595 nm in einem BioPhotometer (Eppendorf,
Germany) vermessen und die in der Probe enthaltene Proteinmenge über die
Kalibriergerade bestimmt.
4.4 Gelelektrophorese
4.4.1 1D-SDS-PAGE
Die eindimensionale SDS-PAGE wurde sowohl für die Analyse der Membranfraktion
als auch für das 1D-Gel-Fraktionierungs-Experiment eingesetzt. Während sie im ersten
Fall vor allem für die Entsalzung der Probe verwendet wurde, diente sie bei Letzterem
vor allem der Fraktionierung der Probe. In beiden Fällen wurde ein diskontinuierliches
Elektrophoresesystem verwendet (Laemmli, 1970). Die Zusammensetzung der eingesetzten
Minigele (6 cm x 8 cm x 1 mm) ist in Tabelle 4.7 beschrieben. Das Sammelgel
hatte eine Länge von 1 cm, das Trenngel von 5 cm.
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