Dokument 2.pdf - OPUS-Datenbank - Universität Hohenheim

3 Einleitung
3.3.7 Labelfreie massenspektrometrische Quantifizierung
Wie bereits in Abschnitt 3.1.3 erläutert, werden bei diesem Ansatz Peptide anstelle
von Proteinen quantifiziert. Dabei kann die Quantifizierung sowohl auf MS- als auch
auf MS/MS-Ebene erfolgen. Obwohl bei der in dieser Arbeit verwendeten Methode die
Quantifizierung auf MS-Ebene erfolgte, werden die aus den MS/MS-Daten gewonnenen
Informationen für die Identifizierung der Peptide und damit der Proteine benötigt.
Zur Quantifizierung der Proben kam der in der Software Progenesis LC-MS (Nonlinear
Dynamics) implementierte Algorithmus zum Einsatz. Das Grundprinzip der Quantifizierung
ist in Abbildung 3.11 schematisch dargestellt und wird im Folgenden kurz
beschrieben. In einem ersten Schritt werden die in einem LC-MS Lauf detektierten
m/z-Werte (Features) auf einer dreidimensionalen Karte dargestellt. Jedes Peptid wird
dabei durch sein Isotopenmuster repräsentiert, wobei die Intensität der Signale auf der
y-Achse, der m/z-Wert und die Retentionszeit auf x- und z-Achse aufgetragen werden.
Ähnlich dem Vorgehen in 2D-Gel-Experimenten (s. Kapitel 4) basiert das folgende
„Alignment“ auf dem graphischen Übereinanderlegen der einzelnen LC-MS-Analysen.
Für die Quantifizierung wird die „Fläche“ des Isotopenmusters eines Peptids über seine
gesamte Elutionszeit herangezogen. Dabei erfolgt die Quantifizierung unabhängig von
einer möglichen Identifizierung. Wurde für ein Peptid kein MS/MS-Spektrum aufgezeichnet,
da es im Rahmen der DDA (Data Dependent Acquisition) nicht fragmentiert
wurde, kann dies in einer unabhängigen LC-MS-Analyse nachgeholt werden. DDA bezeichnet
einen Vorgang, bei dem die höchsten Signale eines MS-Spektrums automatisch
nacheinander selektiert und fragmentiert werden. Nach erfolgter Identifizierung der Peptide
können aus den Einzelintensitäten (Flächen) der Peptide (MS-Ebene) die Werte
für die entsprechenden Proteine berechnet werden.
Die Tatsache, dass bei dieser Methode keinerlei Markierung verwendet wird, kann gleichermaßen
als Vor- und Nachteil angesehen werden. Durch die fehlende Markierung
gibt es grundsätzlich keine Limitierung in Bezug auf die Anzahl der zu vergleichenden
Zustände (Multiplexing). Außerdem ist die Methode deutlich kostengünstiger als vergleichbare
Methoden, welche auf Isotopenmarkierung (SILAC; iTRAQ, etc.) basieren.
Wie auch bei 2D-DIGE ist eine absolute Quantifizierung von Proteinen nicht möglich.
Da die zu vergleichenden Proben in vollständig unabhängigen Analysen untersucht werden,
ist bei der Durchführung auf eine gute Reproduzierbarkeit der Probenvorbereitung
und des LC-MS-Setups zu achten.
32