Dokument 2.pdf - OPUS-Datenbank - Universität Hohenheim

4 Material und Methoden
der unteren Kammer (Anode) einfach konzentriert. Die Elektrophorese wurde bei einer
konstanten Temperatur von 20 ◦ C durchgeführt, die über einen Thermostat kontrolliert
wurde. Pro Gel wurden für die ersten 2 h 10 mA, anschließend 12 mA als Stromstärke
eingestellt. Die Elektrophorese wurde beendet, nachdem das Bromphenolblau den
unteren Rand der Gele erreicht hatte. Im Anschluss wurden die Gele auf einem Typhoon
Trio-plus Fluoreszenzscanner (GE Healthcare) mit einer Auflösung von 100 µm
gescannt. Dabei wurden die Laser- und Filter-Einstellungen den verwendeten Farbstoffe
angepasst. Tabelle 4.10 fasst die entsprechenden Kombinationen zusammen.
Tabelle 4.10: Anregungs- und Emissionswellenlängen der verwendeten Farbstoffe.
Cy-Farbstoff Anregungswellenlänge Emissionswellenlänge
Cy3 532 nm 580 nm
Cy5 633 nm 670 nm
Cy2 488 nm 520 nm
Für jedes analysierte Gel wurden somit drei individuelle Gelbilder erzeugt und diese
anschließend zusammen mit den übrigen biologischen Replikaten eines Versuchs quantitativ
ausgewertet.
4.4.3.5 Auswertung mittels Progenesis SameSpots
Zur quantitativen Analyse der 2D-DIGE-Gele wurde die Software Progenesis Same-
Spots in der Version 4.1 verwendet. Grundsätzlich wurden während aller Analysen die
Voreinstellungen des Herstellers übernommen (http://www.nonlinear.com), weshalb an
dieser Stelle nur kurz auf die einzelnen Arbeitsschritte eingegangen werden soll.
In einem ersten Schritt wurden die aufgenommenen Gelbilder eines Experiments in
die Software geladen und von dieser automatisch auf ihre Qualität hin überprüft. Im
Anschluss wurden die einzelnen Gelbilder (Cy2, Cy3, Cy5) wieder den entsprechenden
Gelen zugeordnet. In einem nächsten Schritt wurde aus den Gelbildern der internen
Standards (Cy2) eines als Referenz ausgewählt und die übrigen Gelbilder mit dieser
Referenz abgeglichen. Ziel dieses so genannten „Alignments“ war es, die Spotmuster
der einzelnen Gelbilder zur Deckung zu bringen und so Laufunterschiede zwischen den
einzelnen Gelen digital auszugleichen. Im Anschluss daran wurden die auf allen Gelbildern
vorhandenen Spots detektiert und auf einem gemeinsamen Bild zusammengeführt.
Sowohl das Alignment als auch die Detektion der „Spots“ erfolgten dabei automatisch
durch die Software. Randbereiche oder schlecht getrennte Bereiche des Gels sowie
Farbartefakte konnten im folgenden Schritt über eine Filterfunktion von der Analyse
ausgeschlossen werden.
56