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1 Zusammenfassung
Induktion der Fettsäurebiosynthese konnte hingegen nicht bestätigt werden.
Im Rahmen der Proteomanalyse des Vanillin-Metabolismus in P. putida KT2440 konnte
eine Induktion des β-Ketoadipat-Weges, über welchen Protocatechuat zu Succinylund
Acetyl-CoA abgebaut wird, gezeigt werden. Zudem fanden sich deutliche Hinweise,
dass das Enzym „Vanillin-Dehydrogenase“ für den initialen Schritt des Vanillin-Abbaus,
der Umsetzung von Vanillin zu Vanillinsäure, in P. putida KT2440 nicht essentiell ist,
sondern auch alternative Enzyme diese Reaktion katalysieren können. Als mögliche
Kandidaten hierfür konnten die Enzyme Coniferylaldehyd-Dehydrogenase (PP_5120)
und Benzaldehyd-Dehydrogenase (PP_1948) sowie weitere Aldehyd-Dehydrogenasen
(PP_2680, PP_0545) identifiziert werden. Wie die verbesserte Akkumulation von Vanillin
in den von Nadja Graf (AG Altenbuchner, Institut für Industrielle Genetik, Universität
Stuttgart) auf Basis der Proteomdaten erzeugten P. putida KT2440-Mutanten
zeigte (nicht veröffentlichte Ergebnisse, Graf und Altenbuchner), können diese Daten
wertvolle Hinweise für die gezielte genetische Manipulation von Bakterien und damit
für die Optimierung biotechnologischer Prozesse liefern. Zudem konnte gezeigt werden,
dass neben den unspezifischen Efflux-Systemen TtgABC und MexE, MexF, OprN auch
für Intermediate des Vanillin-Metabolismus spezifische Transporter wie PcaK/PcaP
und PP_3739/PP_3740 beim Wachstum auf Vanillin induziert sind.
Die Untersuchung des Terpenmetabolismus erfolgte im Gegensatz zu den übrigen in dieser
Arbeit vorgestellten Analysen nicht in P. putida, sondern in P. aeruginosa, da nur
dieser Organismus über die für den Terpenabbau nötige genetische Ausstattung verfügt.
Im Rahmen der durchgeführten GeLCMSMS-Experimente wurde der Metabolismus des
Terpens Citronellol dem der Oktansäure sowie dem von Glucose gegenübergestellt. Es
konnte gezeigt werden, dass der Abbau von Citronellol über die durch das atu- und
liu-Gencluster kodierten Enzyme sowie über die β-Oxidation der Fettsäuren verläuft.
Dabei wurde einzig das Enzym „Very-long chain Acyl-CoA Synthetase“ (AtuH) nicht
identifiziert. Die Proteomanalyse offenbarte jedoch eine Reihe möglicher alternativer
unter Citronellol regulierter Acyl- und Acetyl-CoA-Synthetasen, welche diesen Schritt
katalysieren könnten. Die Analyse verschiedener, der β-Oxidation zugeordneter Enzyme
zeigte zudem, dass einige Enzyme möglicherweise eine Präferenz für Terpene (Citronellol)
im Gegensatz zu unverzweigten Carbonsäuren (Oktansäure) aufweisen.
Neben den quantitativen Proteomanalysen im Rahmen der biotechnologischen Teilprojekte,
beinhaltete diese Arbeit auch die Etablierung von geeigneten Analysemethoden.
So konnten insbesondere für die Quantifizierung von Membranproteinen und
des Gesamtproteoms geeignete Methoden der Probenvorbereitung und Quantifizierung
etabliert werden. Mit Hilfe einer Carbonatextraktion und anschließender labelfreier
massenspektrometrischer Quantifizierung konnte eine Vielzahl von, in 2D-DIGE-
Analysen nur schwer zu erfassenden, Membranproteinen identifiziert und quantifiziert
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