Dokument 2.pdf - OPUS-Datenbank - Universität Hohenheim

5 Ergebnisse
pH-Gradienten lediglich vier zusätzliche regulierte Proteine detektiert werden. Gleichzeitig
führte der breitere pH-Gradient zu einer geringeren Zahl regulierter Spots im
pH-Bereich pH 4-7 (13 Spots im Vergleich zu 21 Spots), was sich durch die geringere
Auflösung dieses IPG-Streifens (pH 3-11) erklären lässt. Aufgrund des minimalen Zugewinns
an regulierten Spots durch die Verwendung des breiten pH-Gradienten und dem
gleichzeitigen deutlichen Verlust an Auflösungsvermögen wurde für alle weiteren Experimente
IPG-Streifen mit einem pH-Gradienten von pH 4-7 eingesetzt. Die Verwendung
dieses pH-Gradienten führte, bedingt durch das höhere Auflösungsvermögen, auch zu
einer Reduktion co-migrierender Proteinspots und damit zu einer geringeren Anzahl
unterschiedlicher Proteine je Spot.
Das höhere Auflösungsvermögen ändert jedoch nichts daran, dass mit modernen Massenspektrometern
häufig mehrere Proteine in einem einzigen Spot identifiziert werden
können und somit das eigentlich regulierte Protein nicht immer eindeutig identifiziert
werden kann. Häufig wird daher das abundanteste Protein eines Spots als das regulierte
Protein angesehen, wobei die Abundanz eines Proteins aus der Anzahl der identifizierten
Peptide dieses Proteins abgeleitet wird. Wie Timms et al. (2008) zu bedenken geben, ist
diese Annahme jedoch nicht immer korrekt. Aufgrund dieser Limitierung ist 2D-DIGE
in erster Linie als Screening-Methode zu betrachten, welche die Anzahl möglicher regulierter
Proteine im Vergleich zur Gesamtprobe deutlich einschränkt. Eine Überprüfung
der Ergebnisse mit unabhängigen Methoden ist aber in jedem Fall sinnvoll. Angesichts
des hohen dynamischen Bereichs, sowie des hohen Auflösungsvermögens ist 2D-DIGE
nichtsdestotrotz eine optimale Technologie für die Analyse komplexer Proben und die
Untersuchung regulatorischer Netzwerke.
Zusätzlich zur Evaluierung der pH-Bereiche wurden auch alternative Fluoreszenzfarbstoffe
(G-Dyes, NH DyeAGNOSTICS GmbH) mit den oben beschriebenen Proben in
einem pH 4-7-Gradienten getestet. G-Dyes weisen ähnliche Anregungs- und Emissionswellenlängen
wie Cy-Dyes auf, sind in ihrem Molekulargewicht jedoch nicht ausbalanciert.
Für die Auswertung der G-Dye-Gelbilder mit der Analysesoftware konnten daher
die gleichen Parameter wie für Auswertung der Cy-Dye Gel-Gelbilder herangezogen
werden. Insgesamt konnten 1621 Spots (2033 vor Bereinigung) detektiert werden. Hiervon
waren 68 nach statistischen Kriterien reguliert. 27 Spots verblieben nach manueller
Validierung. Ein Vergleich mit dem im gleichen pH-Bereich durchgeführten Cy-Dye
Experiment ergab, dass sich 16 Spots mit bereits identifizierten Spots aus diesem Gel
deckten. Daher wurden lediglich 11 Spots, welche ausschließlich in dem mit G-Dyes
durchgeführten Experiment reguliert waren, massenspektrometrisch analysiert. Diese
zusätzlich identifizierten Spots zeigen, dass sich beide getesteten Farbstoffe in ihrer Sensitivität
für bestimmte Proteine unterscheiden und daher als teilweise komplementär
anzusehen sind. Da durch die Verwendung von G-Dyes kein genereller Gewinn an Sen-
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