Dokument 2.pdf - OPUS-Datenbank - Universität Hohenheim
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4 Material und Methoden<br />
Tabelle 4.13: Aufbau der für die 1D-Gel-Fraktionierung im A) Butanol- und B) Vanillin-<br />
Teilprojekt verwendeten UPLC-Gradienten<br />
A) Butanol Teilprojekt B) Vanillin Teilprojekt<br />
Zeit (min) %A %B Zeit (min) %A %B<br />
1 99 1 1 99 1<br />
60 50 50 90 60 40<br />
65 15 85 95 15 85<br />
70 15 85 100 15 85<br />
75 99 1 101 99 1<br />
4.5.3.1 Quantitative Analyse von Membranproteinen<br />
Wie in Abschnitt 4.4.1 beschrieben wurden die in Abshcnitt 4.3.3 erzeugten Proben über<br />
ein 1D-Gel entsalzt, als Block ausgeschnitten und anschließend verdaut. Dies erfolgte<br />
simultan für alle in einem Experiment analysierten Proben (drei biologische Replikate<br />
pro Zustand). Vor der massenspektrometrischen Analyse wurde die optimale Verdünnung<br />
der Probe über Testläufe ermittelt. Im Anschluss wurden 5 µl der verdünnten<br />
Proben injiziert und analysiert. Für die Auswertung der Daten wurde die Software<br />
Progenesis LC-MS verwendet, welche bereits in der Einleitung (Abschnitt 3.3.5) kurz<br />
vorgestellt wurde. In weiten Teilen ist das Design der Datenanalyse zu dem in der<br />
Software Progenesis SameSpots (s. Abschnitt 4.4.3.5) analog.<br />
Zu Beginn wurden die von der LTQ Orbitrap XL erzeugten Ergebnisdateien (.raw)<br />
in die Software importiert und von dieser als Contour Plot dargestellt. Als Contour-<br />
Plot wird die dreidimensionale Darstellung eines LC-MS-Laufs bezeichnet. Dabei werden<br />
die detektierten m/z-Verhältnisse und deren Elutionszeiten in einem Koordinatensystem<br />
aufgetragen (Abbildung 3.11). Die Intensität eines m/z-Verhältnisses wird<br />
durch eine „Heatmap“ kodiert. Da zu diesem Zeitpunkt der Analyse noch keine Peptid-<br />
Identifizierungen in die Software übertragen werden können, werden die Isotopenmuster<br />
der detektierten m/z-Verhältnisse als „Features“ bezeichnet. Anhand der Contour Plots<br />
wurde eine der Analysen als Referenz ausgewählt und die übrigen Contour Plots, ähnlich<br />
wie bei der 2D-DIGE-Analyse, mit dieser abgeglichen. Hierzu wurden die einzelnen<br />
Contour-Plots durch manuell gesetzte Vektoren gegeneinander verschoben und bestmöglich<br />
zur Deckung gebracht. Im Anschluss wurde dieses Alignment durch automatisch<br />
von der Software generierte Vektoren ergänzt und verbessert. Dies ermöglichte es,<br />
Retentionszeit-Schwankungen zwischen den einzelnen LC-MS-Analysen auszugleichen.<br />
Nach erfolgtem Alignment wurden die Features aller Contour Plots in einem Master-<br />
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