Dokument 2.pdf - OPUS-Datenbank - Universität Hohenheim

4 Material und Methoden
0,05% Oktansäure + 0,1% Citronellol; 0,05% Oktansäure + 0,1% Citronellsäure; 0,1%
Oktansäure und 0,4% Glucose. Die Ernte der Zellen erfolgte bei 200 Klett-Einheiten
durch Zentrifugation bei 7.000 rpm für 10 min. Im Gegensatz zu den übrigen Versuchen
wurden die Zellen nach der Zentrifugation nicht gewaschen, sondern bei -80 ◦ C bis zur
weiteren Verwendung gelagert. Der Aufschluss der Zellen erfolgte über eine French-
Press. Für eine genauere Beschreibung der Kultivierung sei auf die Diplomarbeit von
Nadine Walter verwiesen (Walter, 2012).
4.2.4 Kultivierung von Pseudomonas putida KT2440 im
Bioreaktor
Die Kultivierung der für die Metabolom-, Transkriptom- und Proteom-Analyse benötigten
Bakterien wurde am Institut für Bioverfahrenstechnik der Universität Stuttgart
von Tobias Vallon (AG Takors, Institut für Bioverfahrenstechnik, Universität Stuttgart)
durchgeführt. Daher soll die Anzucht der Bakterien im Reaktor hier nur kurz
beschrieben werden.
Zu Beginn wurde 13,6 ml eines Glycerolstocks von P. putida KT2440 in einen Schüttelkolben
mit 130 ml M12-BVT Medium mit 4 g/l Glucose überführt und für 6 h bei
30 ◦ Cbis zu einer OD 600 von 3,5 kultiviert. Anschließend wurde diese Vorkultur in einen
3,7 l KLF Bioreaktor in welchem 1350 ml M12-BVT Medium mit 4 g/l Glucose vorgelegt
waren transferiert. Die Kultivierung wurde bei 30 ◦ C, einem ∆p von 0,5 bar, einer
Begasungsrate (VG) von 2 Nl/min und einem pO 2 > 30% (Sättingung der Gelöstsauerstoffkonzentration
in %) durchgeführt. Der pH Wert wurde durch 25% NH 4 OH bei
pH 7 konstant gehalten. Die Rührerdrehzahl variierte zwischen 300 und 1.200 rpm und
diente dazu eine Gelöstsauerstoffkonzentration > 30% zu gewährleisten.
Der Bioreaktor wurde bis zum Erreichen der C-Limitierung im Batch-Verfahren betrieben
(OD 600 ∼ 10). Im Anschluss wurde die kontinuierliche Kultivierung unter Glucoselimitierung
(Verdünnungsrate D= 0,1 h -1 ) gestartet. Als Feedmedium wurde M12-
BVT Medium mit 10 g/l Glucose verwendet. Nach 50 h kontinuierlicher Kultivierung
(5 Verweilzeiten) wurden die ersten Proteomproben (Steady-State I) aus dem Reaktor
entnommen (3 x 5 ml) und analog zu den Schüttelkolbenexperimenten pelletiert und
gewaschen. Im Anschluss an die Probenahme erfolgte der Wechsel des Feedmediums auf
M12-BVT 10 g/l Glucose + 0,75 g/l Butanol. Nach weiteren fünf Verweilzeiten (ca. 50 h)
wurden erneut Proben entnommen (Steady-State II) und ein Wechsel des Feedmediums
auf M12-BVT Medium 10 g/l Glucose + 7,5 g/l Butanol durchgeführt. Nach weiteren
50 h erfolgte eine letzte Probenahme (Steady-State III) aus dem Bioreaktor. Insgesamt
wurden sechs Kultivierungen im Bioreaktor durchgeführt. Pro Zustand (Steady-State I,
II, III) waren am Ende je drei biologische Replikate für die Proteomanalyse vorhanden.
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