Dokument 2.pdf - OPUS-Datenbank - Universität Hohenheim

4.5 Massenspektrometrie
4.5 Massenspektrometrie
4.5.1 In-Gel-Verdau
Das für den Verdau von Gelproben eingesetzte Protokoll basiert im wesentlichen auf der
von Shevchenko et al. (1996) publizierten Methode zum Verdau silbergefärbter Gele für
massenspektrometrische Analysen. Dieses Protokoll wurde sowohl für die Verwendung
mit einem Digest Pro MS-Verdauroboter (Intavis) als auch für den manuellen Verdau
in leicht abgewandelter Form eingesetzt. Der Verdau der Gelproben war dabei für aus
1D- und 2D-Gelen ausgestochene (ausgeschnittene) Proben identisch, die eingesetzten
Volumina wurden jedoch gegebenenfalls an die Größe der Gelstücke angepasst. Das
Protokoll für den Verdau von Proben mit Hilfe des Roboters befindet sich im Anhang
(s. Anahng), der manuelle Verdau wird im Folgenden kurz beschrieben.
In einem ersten Schritt wurden die Gelstücke für 5 min bei Raumtemperatur mit 200 µl
H 2 O unter Schütteln gewaschen und der Überstand verworfen. Um den Gelstücken
das Wasser zu entziehen, wurden im Anschluss 150 µl Acetonitril (ACN) zugegeben,
die Gelstücke für 10 min unter Schütteln inkubiert und der Überstand verworfen. Im
Anschluss wurden die Cysteine in der Probe durch Inkubation mit 100 µl 100 mM
NH 4 HCO 3 /10 mM DTT für 30 min bei 56 ◦ C reduziert. Der Überstand wurde verworfen
und den Gelstücken mit 150 µl ACN für 10 min die verbliebene Lösung entzogen. Im
Anschluss wurden die Gelstücke mit 85 µl 100 mM NH 4 HCO 3 / 55 mM IAA für 20 min
bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert und somit die reduzierten Cysteine alkyliert.
Der Überstand wurde abgenommen, die Gelstücke mit 150µl 100 mM NH 4 HCO 3
für 10 min inkubiert und der Überstand erneut verworfen. Anschließend wurden die Gelstücke
durch die Zugabe von 150 µl ACN für 10 min dehydriert. Für den Verdau von
2D-DIGE-Spots wurden 24 µl 10 ng/µl Trypsin in 40 mM NH 4 HCO 3 auf die Gelstücke
gegeben und für 30 min auf Eis inkubiert. Beim Verdau größerer Banden aus 1D-Gelen
wurde die Trypsinmenge (15 ng/µl) entsprechend angepasst. Nach der Inkubation wurden
die Proben mit 40 mM NH 4 HCO 3 aufgefüllt, bis die Gelstücke komplett mit Flüssigkeit
bedeckt waren. Der Verdau erfolgte über Nacht bei 37 ◦ C in einem Brutschrank
und wurde am nächsten Morgen durch Zugabe von 1 µl 10% Trifluoressigsäure(TFA)
gestoppt. Der Überstand wurde anschließend in ein neues Probengefäß überführt und in
einem SpeedVac Concentrator 5301 komplett getrocknet. Für die anschließende massenspektrometrische
Analyse wurde die Probe in 15 µl (2D-DIGE-Spots) bzw. 60 µl
(1D-Gelbanden) 0,1% Methansäure (FA) resuspendiert.
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