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5.3 Untersuchungen zum Vanillin-Metabolismus
5.3.5 Metabolitenanalysen
Um die aus den Proteomdaten gewonnenen Erkenntnisse zum Abbau von Vanillin zu
verifizieren, wurden zusätzlich HPLC-Analysen verschiedener Metaboliten im Kulturüberstand
durchgeführt. Hierzu wurde P. putida KT2440 und die Mutante P. putida
GN235 in 100 ml M12-BASF Medium mit 0,1% Vanillin als Kohlenstoffquelle kultiviert.
Für die Analysen wurden alle zwei Stunden jeweils 1 ml Bakteriensuspension entnommen
und der nach einem Zentrifugationsschritt erhaltene bakterienfreie Überstand auf
das Vorhandensein von Vanillin, Vanillinsäure, Protocatechuat, Vanillylalkohol und 4-
Hydroxybenzoat untersucht. Die beiden letztgenannten Substanzen wurden aufgrund
der Ergebnisse der Proteom-Analysen (s. Abschnitt 5.3.1 - 5.3.3) ausgewählt, da vermutet
wurde, dass diese mögliche Zwischenprodukte des Vanillin-Abbaus darstellen.
Die Induktion der Alkoholdehydrogenase (PedE) in der 2D-DIGE-Analyse legte zudem
einen möglichen Abbau von Vanillin zu Vanillylalkohol nahe. Die Induktion der
4-Hydroxybenzoat-Hydroxylase (PobA, PP_3537) wiederum könnte ein Hinweis auf
die Entstehung von 4-Hydroxybenzoat während des Vanillin-Abbaus sein.
Alle fünf Referenz-Substanzen konnten mit Hilfe des in Abschnitt 4.6 beschriebenen
HPLC-Gradienten auf einer RP-C 18 -Säule getrennt und mittels UV-Detektor bei einer
Wellenlänge von 260 nm erfasst werden (Abbildung 5.32, A). Die drei Substanzen Protocatechuat,
Vanillylalkohol und 4-Hydroxybenzoat konnten zu keinem der untersuchten
Zeitpunkte in keiner der analysierten Proben aus den beiden Pseudomonas-Stämmen
KT2440 und GN235 nachgewiesen werden. Vanillin und Vanillinsäure wurden hingegen
zu verschiedenen Zeitpunkten in unterschiedlichen Konzentrationen im Überstand
detektiert (Abbildung 5.32, B). Da lediglich der Kulturüberstand untersucht wurde,
lässt sich keine Aussage über die intrazellulären Konzentrationen der einzelnen Substanzen
treffen. Unterschiede zwischen dem Wildtyp und der Mutante GN235 konnten
auch in diesem Experiment nicht festgestellt werden. Nach 10 h konnte Vanillin nicht
mehr nachgewiesen werden. Nach etwa acht Stunden nahm auch die Konzentration
von Vanillinsäure kontinuierlich ab. Zum Zeitpunkt der Entnahme der Proben für die
Proteomanalyse (t=12, OD 600 = 0.6) war somit lediglich Vanillinsäure, nicht jedoch
Vanillin im Überstand nachweisbar.
Auffällig ist, dass Vanillin schnell zu Vanillinsäure umgesetzt und in das umgebende
Medium abgegeben wurde. Dies könnte darauf hinweisen, dass nur ein Teil des zur
Verfügung stehenden Vanillins direkt zur Energiegewinnung verwendet wurde. Der geschwindigkeitsbestimmende
Schritt des Vanillin-Abbaus wäre demnach die Umsetzung
von Vanillinsäure zu Protocatechuat durch VanA/VanB. Da bei dieser Reaktion die
ebenfalls zytotoxische Substanz Formaldehyd entsteht (Jiménez et al., 2004), könnte
die Geschwindigkeit des notwendigen Abbaus von Formaldehyd zu CO 2 ebenfalls die
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