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3 Einleitung
3.3.8 Selected reaction monitoring (SRM)
Im Gegensatz zu den zuvor beschriebenen Quantifizierungsmethoden, welche als „Screening-Methoden“
zu betrachten sind, stellt SRM (Selected Reaction Monitoring) einen
labelfreien Ansatz zur gezielten Quantifizierung (aber auch Identifizierung) bestimmter
Proteine dar. Dabei können sowohl Proteine, die bereits in einer vorherigen LC-MS-
Analyse identifiziert wurden als auch nicht identifizierte Proteine (sofern deren Aminosäuresequenz
bekannt ist) in die Untersuchung mit einbezogen werden (Picotti et
al., 2009). Die Quantifizierung der Proteine erfolgt hierbei über eine repräsentative
Auswahl von Peptiden, die stellvertretend für das entsprechende Protein quantifiziert
werden. Als SRM-Übergang wird die Kombination des m/z-Verhältnisses des gesuchten
Peptids und eines Fragments dieses Peptids bezeichnet. Die Auswahl geeigneter
Peptide ist dabei entscheidend für die Sensitivität und Selektivität der Methode. Für
SRM-Übergänge ausgewählter Peptide sollten sowohl einzigartig für ein zu quantifizierendes
Protein, als auch massenspektrometrisch gut detektierbar sein (Mallick et al.,
2007). Außerdem sollten diese so genannten „proteotypischen Peptide“ (PTPs) keine
Modifikationen aufweisen, um eine Aufspaltung des SRM-Signals zu verhindern. Insbesondere
die Beurteilung der Detektierbarkeit der ausgewählten Peptide und deren
Fragmente stellt ein Problem dar. Neben der empirischen Suche nach geeigneten Peptiden
und Übergängen mittels eines vorgeschalteten Identifizierungslaufs (DDA) können
proteotypische Peptide auch mit geeigneten Programmen vorhergesagt werden (Mallick
et al., 2007). In beiden Fällen sollten die identifizierten SRM-Übergänge allerdings mittels
einer „SRM triggered MS/MS-Analyse“ validiert werden. Dabei löst die Detektion
eines SRM-Übergangs am Detektor die Aufnahme eines MS/MS-Spektrums aus, welches
dann zur Überprüfung des Peptid-/Precursor-Ions verwendet werden kann und
somit sicherstellt, dass mit den gewählten Parametern auch tatsächlich das gewünschte
Peptid detektiert wird.
Für die Quantifizierung eines Peptids werden der erste (Q1) und dritte Quadrupol
(Q3) eines Triple-Quadrupole-Massenspektrometers als Massenfilter eingesetzt und auf
das m/z-Verhältnis des Peptid-Ions (Q1) bzw. eines für das Peptid charakteristischen
Fragment-Ions (Q3) eingestellt (Abbildung 3.12). Die für einen Übergang am Detektor
gemessene Ionenspur (Intensität über Zeit) ist zur Menge des Peptides proportional.
Um die Verlässlichkeit der Identifizierung und Quantifizierung zu erhöhen, werden pro
Peptid in der Regel mehrere SRM-Übergänge betrachtet. Pro Peptid werden somit
mehrere Fragmentionen analysiert. Hierdurch können auch isobare Peptide, welche das
gleiche m/z-Verhältnis, aber eine unterschiedliche Aminosäuresequenz besitzen, unterschieden
werden. Zusätzlich können vor der eigentlichen Quantifizierung zur Steigerung
der Sensitivität verschiedene Geräteparameter wie die Kollisionsenergie (CE) und das
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