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3.3 Massenspektrometrie und quantitative Proteomanalyse
Studien verschoben. Dies ist vor allem für die Systembiologie von großem Interesse, da
die Betrachtung quantitativer Veränderungen des Proteoms auch Rückschlüsse auf die
Funktion und Regulation des untersuchten Netzwerkes zulässt. Im Folgenden werden
die in dieser Arbeit angewandten Quantifizierungsmethoden kurz beschrieben. Für eine
umfangreiche Zusammenfassung aktueller Quantifizierungsmethoden sei auf Schulze
bzw. Bantscheff et al. (Schulze et al., 2010; Bantscheff et al., 2007) verwiesen.
3.3.6 Zweidimensionale Gelelektrophorese und 2D-DIGE
Bei dieser Technik erfolgt die Auftrennung eines Proteingemisches in zwei Schritten.
Während der isoelektrischen Fokussierung (IEF) werden die Proteine nach ihrem isoelektrischen
Punkt aufgetrennt und anschließend in einer SDS-PAGE aufgrund ihres
Molekulargewichts separiert. Das hohe Auflösungsvermögen der 2D-SDS-PAGE sowie
die Vielseitigkeit der möglichen Anwendungen (verschiedene pH-Bereiche, Blots, Färbemethoden,
etc.) machen diese Technik zu einer der weitverbreitetsten Anwendungen bei
der Analyse komplexer Protein-Proben. Die 2D-SDS-PAGE erlaubt die reproduzierbare
Auftrennung komplexer Proteingemische in mehr als 2.000 Spots, wobei auch Proteinisoformen
und posttranslationale Modifikationen (PTMs) separiert werden können.
Ein aktueller Review, welcher den gegenwärtigen Stand der 2D-SDS-PAGE beleuchtet,
wurde von Görg et al. (2009) verfasst.
Die Verbindung der isoelektrischen Fokussierung in durch Trägerampholyte aufgebauten
pH-Gradienten mit der von Laemmli (1970) entwickelten SDS-PAGE wurde 1975
von O’Farrell vorgestellt (Svensson et al., 1961; Vesterberg et al., 1966; O’Farrell,
1975). Während bei der „klassischen“ IEF die Ampholyte frei in dem verwendeten
Polyacrylamidgel vorliegen und erst in einem elektrischen Feld einen pH-Gradienten
aufbauen, ist bei den so genannten immobilisierten pH-Gradienten (IPG) der Gradient
bereits vor dem Anlegen der Spannung vorhanden (Bjellqvist et al., 1982; Görg
et al., 1988). Dieser pH-Gradient basiert auf sauren und basischen Acrylamidderivaten
(Immobiline), welche bei der Herstellung des IPG-Streifens in den Gelstreifen einpolymerisiert
werden. Durch eine Derivatisierung der Proteine im Anschluss an die isoelektrische
Fokussierung wird der Übergang der Proteine in die zweite Dimension sowie
deren quantitative Beladung mit SDS ermöglicht (Görg et al., 1987).
Die Detektion der Proteine im Gel erfolgt im Anschluss durch verschiedene Färbemethoden.
Diese Methoden unterscheiden sich dabei sowohl in ihrer Sensitivität als auch
in ihrem linearen Bereich. Letzteres sowie die häufig geringe Reproduzierbarkeit der
Färbungen erschweren oft eine quantitative Betrachtung der Ergebnisse. Hinzu kommen
technische Varianzen zwischen den einzelnen Gelen eines Experimentes. Fluoreszenzfarbstoffe
wie Sypro Ruby (Berggren et al., 2000) zeigen zwar eine der klassischen
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