Dokument 2.pdf - OPUS-Datenbank - Universität Hohenheim

4.5 Massenspektrometrie
der Validierung und Ergänzung der durch Mascot erhaltenen Daten.
Nach erfolgter Suche wurden die Identifizierungen einer statistischen Auswertung unterzogen.
Dabei wurden sowohl die Mascot- als auch die X!Tandem-Datenbanksuche sowie
die von beiden Suchmaschinen eingesetzten Scoring-Systeme berücksichtigt. Das Prinzip
des „Scoring“ wird im Folgenden anhand des Mascot-Algorithmus erläutert. Um die
Qualität der Identifizierung eines MS/MS-Spektrums durch den Mascot-Suchalgorithmus
zu beurteilen, werden von Mascot die beiden Größen „Mascot-Ion-“ und „Mascot-
Identity-Score“ verwendet. Dabei stellt der „Mascot-Ion-Score“ ein Maß für die Wahrscheinlichkeit
dar, dass die Identifizierung des Spektrums rein zufällig erfolgt. Je kleiner
der Mascot-Ion-Score, desto höher die Wahrscheinlichkeit, dass es sich bei einer gegebenen
Identifizierung um ein zufälliges Ereignis handelt. Der Mascot-Identity-Score kann
hingegen als Schwellenwert für ein vorgegebenes Signifikanzniveau (p < 0,05) angesehen
werden. Ein „Mascot-Ion-Score“ welcher unter dem „Mascot-Identity-Score“ liegt, wird
als nicht signifikant angesehen.
Basierend auf diesen beiden Größen berechnet der in Scaffold implementierte „Peptide
Prophet Algorithmus“ eine Verteilung des so genannten „Discrimination Scores“
(Mascot-Ion-Score minus Mascot-Identity-Score) und leitet daraus eine Wahrscheinlichkeit
für „Korrektheit“ einer Identifizierung mit einem bestimmten Mascot-Ion-Score
ab (Abbildung 4.3) (Keller et al., 2002).
Für die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Analysen wurden folgende Kriterien
festgelegt: Peptide wurde als identifiziert betrachtet, wenn sie eine Peptid-Wahrscheinlichkeit
von 80% oder mehr aufwiesen. Ein Protein musste mit mindestens zwei Peptiden
und einer Protein-Wahrscheinlichkeit von 99% identifiziert werden, um als identifiziert
zu gelten. Dabei wurde die Protein-Wahrscheinlichkeit mit Hilfe des Protein Prophet
Algorithmus auf Basis der Peptid-Wahrscheinlichkeiten berechnet (Nesvizhskii et al.,
2003). Zudem wurde sowohl eine „False Discovery Rate“ (FDR) auf Peptid-, als auch auf
Proteinebene ausgegeben. Die aus dieser Analyse erhaltenen Ergebnisse wurden dann in
einem zweiten Schritt (s. Abschnitt 4.5.5) mit Informationen aus weiteren Datenbanken
vervollständigt.
Abweichend von dem hier beschriebenen Vorgehen wurden die Proben des Ethylenglycol-Teilprojekts
lediglich mit Mascot gegen die NCBI-Datenbank (Kategorie: Bakterien)
gesucht. Eine zweite Suche mit X! Tandem entfiel.
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