Dokument 2.pdf - OPUS-Datenbank - Universität Hohenheim

4.4 Gelelektrophorese
Abbildung 4.2: Normalisierung eines Gelbildes (Cy5) auf den zugehörigen internen Standard
(Cy2).
Der Normalisierungsfaktor berechnet sich auf Basis der Verteilung des Verhältnisses der Spotvolumina
im zu normalisierenden Gelbild und dem internen Standard des gleichen Gels.
Für die anschließende Normalisierung der Cy3- und Cy5-Gelbilder auf den internen
Standard (Cy2) des gleichen Gels wurde das von der Software vorgegebenen Verfahren
genutzt. Hierbei wurde für jeden Spot eines Gelbildes (z.B. Cy3) das Verhältnis der
Spottvolumina (Intensität x Fläche) zwischen diesem und dem zugehörigen internen
Standard ermittelt. Dieser Quotient wurde logarithmiert und in einem Koordinatensystem
aufgetragen (Abbildung 4.2). Unter der Annahme, dass sich nur ein kleiner
Teil der Spotvolumina zwischen den beiden untersuchten Zuständen unterscheidet und
der Großteil konstant bleibt, müsste sich somit eine Verteilung um den Wert 0 ergeben.
Aufgrund technischer Varianzen (systematischer Fehler) ist die Verteilung jedoch
meist um einen bestimmten Faktor verschoben. Dieser Faktor stellt den Korrekturfaktor
der Verteilung und damit den Normalisierungsfaktor dar. Um einen Vergleich
zwischen den Gelen zu ermöglichen, wurden im Anschluss an die Normalisierung die
internen Standards der drei in einem Versuch analysierten Gele ebenfalls gleichgesetzt.
Hierdurch konnten systematische Fehler wie unterschiedliche Proteinbeladung zwischen
den Proben oder variierende Scanner-Sensitivität zwischen den verwendeten Farbstoffen
ausgeglichen werden.
Für die Analyse der Regulation wurden alle Replikate eines Zustands (Cy3 bzw. Cy5)
in einer Gruppe zusammengefasst. Die Regulation eines Spots wurde dann anhand des
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