Dokument 2.pdf - OPUS-Datenbank - Universität Hohenheim

4 Material und Methoden
30 min im Dunkeln auf Eis inkubiert. Die Farbstoffe wurden zuvor nach Angaben des
Herstellers in Dimethylformamid gelöst. Um die Kopplungsreaktion zu stoppen und
noch nicht gebundenen Farbstoff abzufangen, wurde zu jeder Probe 1 µl 10 mM Lysin
gegeben und die Proben für 10 min auf Eis inkubiert. Im Anschluss daran wurden
die beiden Proben, welche nun mit Cy3 und Cy5 markiert waren, mit dem internen
Standard (Cy2) vereint.
Die weiteren Schritte unterschieden sich je nach verwendetem pH-Gradienten. Streifen
mit einem pH-Gradienten von pH 3-11 wurden über so genanntes „Cup-Loading“ mit
Probe beladen, während Streifen mit einem pH-Gradienten von pH 4-7 bereits während
der Rehydrierung des IPG-Streifens mit Probe beladen wurden („Rehydration-
Loading“).
IPG-Streifen pH 4-7
Um eine größere Proteinmenge für die massenspektrometrische Analyse zur Verfügung
zu haben, wurden jedem Probenmix zusätzlich 50 µg nicht markierter interner Standard
zugesetzt. Im Anschluss wurden dem Probenmix 5 µl Pharmalyte und 2 µl Bromphenolblau
hinzugefügt. Das Gesamtvolumen wurde mit Rehydrierungspuffer auf 500 µl
eingestellt und der Probenmix für mindestens 1 h bei Raumtemperatur inkubiert.
IPG-Streifen pH 3-11
Dem Probenmix für das „Cup-Loading“ wurde kein zusätzliches Protein zugesetzt. Zu
den 150 µg Protein wurden 15,4 µl 2 x Probenpuffer sowie 1 µl IPGs (3-11 NL) hinzugefügt.
Anschließend wurde der Probenmix mit DIGE-Lysepuffer auf 100 µl Gesamtvolumen
aufgefüllt und bei Raumtemperatur für mindestens 1 h inkubiert.
4.4.3.3 Die 1. Dimension (IEF)
Wie im vorherigen Abschnitt erwähnt, erfolgte die Beladung der IPG-Streifen auf zwei
unterschiedliche Arten. Das so genannte „Rehydration Loading“ wurde für die 24 cm
langen IPG-Streifen mit einem pH-Bereich von pH 4-7 verwendet. Hierzu wurden die
trockenen Streifen über Nacht mit dem Probenmix (500 µl) inkubiert. Für die isoelektrische
Fokussierung wurden die Streifen in einen Ettan TM IPGphor 3 (GE Healthcare)
überführt und die Fokussierung mit den in Tabelle 4.9 angegebenen Einstellungen
durchgeführt. Die maximale Stromstärke wurde auf 75 µA pro Streifen begrenzt um
einer zu starken Erwärmung der Gelstreifen entgegen zu wirken.
Die 24 cm langen IPG-Streifen mit einem pH-Bereich von pH 3-11 wurden über das so
genannte „Cup-Loading“ beladen. Hierzu wurden die IPG-Streifen über Nacht in 500 µl
Rehydrierungspuffer rehydriert und anschließend in den Ettan TM IPGphor 3 (GE Heal-
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