Dokument 2.pdf - OPUS-Datenbank - Universität Hohenheim

Inhaltsverzeichnis
4.2.3 Kultivierung im Schüttelkolben . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
4.2.3.1 Kultivierung Ethylenglycol- und Glyoxylsäure-
Metabolismus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
4.2.3.2 Kultivierung Butanol-Metabolismus . . . . . . . . . . 46
4.2.3.3 Kultivierung Vanillin-Metabolismus . . . . . . . . . . . 47
4.2.3.4 Kultivierung Terpen-Metabolismus . . . . . . . . . . . 47
4.2.4 Kultivierung im Bioreaktor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
4.3 Probenvorbereitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
4.3.1 Aufschluss von Bakterienzellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
4.3.2 Probenvorbereitung für die 2D-DIGE-Analyse . . . . . . . . . . 49
4.3.3 Probenvorbereitung der Membranprotein-Proben . . . . . . . . 49
4.3.4 Probenvorbereitung GeLCMSMS-Analyse . . . . . . . . . . . . 50
4.3.5 Bestimmung des Proteingehalts nach Bradford . . . . . . . . . . 50
4.4 Gelelektrophorese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
4.4.1 1D-SDS-PAGE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
4.4.2 Proteinfärbung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
4.4.2.1 Coomassie-Färbung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
4.4.2.2 Silberfärbung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
4.4.3 2D-DIGE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
4.4.3.1 Herstellung der Gele . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
4.4.3.2 Markierung der 2D-DIGE-Proben . . . . . . . . . . . . 53
4.4.3.3 Die 1. Dimension (IEF) . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
4.4.3.4 Die 2. Dimension (SDS-PAGE) . . . . . . . . . . . . . 55
4.4.3.5 Auswertung mittels Progenesis SameSpots . . . . . . . 56
4.4.3.6 Spot Picking . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
4.5 Massenspektrometrie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
4.5.1 In-Gel-Verdau . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
4.5.2 Identifizierung von Proteinen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
4.5.3 Labelfreie massenspektrometrische Quantifizierung . . . . . . . 61
4.5.3.1 Quantitative Analyse von Membranproteinen . . . . . 62
4.5.3.2 Quantitative Analyse der GeLCMSMS-Daten . . . . . 63
4.5.4 Datenbanksuche . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
4.5.5 Datenanalyse und Annotierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
4.5.6 Quantifizierung von Proteinen mittels SRM (Selected Reaction
Monitoring) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
4.5.6.1 Probenvorbereitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
4.5.6.2 SRM-Analyse und quantitative Auswertung . . . . . . 67
4.6 Quantifizierung der Metabolite des Vanillinstoffwechsels . . . . . . . . . 69
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