Dokument 2.pdf - OPUS-Datenbank - Universität Hohenheim

4.5 Massenspektrometrie
Image vereint und mögliche Kontaminationen durch Hintergrundionen mit Hilfe von
Filterkriterien von der weiteren Analyse ausgeschlossen. Für die folgende Normalisierung
wurden nur Features berücksichtigt, welche einen m/z-Wert zwischen 250 und
1.800 aufwiesen und 2-, 3- oder 4-fach positiv geladen waren. Zudem wurden nur Features
in die Analyse einbezogen, welche während des Gradienten und nicht während
des Spülschritts eluierten (s. UPLC-Methode, Tabelle 4.12).
Im Anschluss wurden alle LC-MS-Läufe mit Hilfe des ausgewählten Referenzlaufes normalisiert.
Dieser Schritt war mit der Normalisierung im Rahmen der 2D-DIGE-Analyse
identisch (s. Abschnitt 4.4.3). Da im Gegensatz zu einer 2D-DIGE-Analyse kein interner
Standard vorhanden war, wurden die Features der verschiedenen LC-MS-Läufe in
Relation zu Features der für das Alignment ausgewählten Referenz normalisiert. Im
Detail ist dieses Verfahren auf der Seite des Herstellers (http://www.nonlinear.com)
beschrieben.
Im Anschluss an die Normalisierung wurden die LC-MS-Läufe der biologischen Replikate
eines Zustands (z.B. Glucose) gruppiert und für jedes Feature dessen Regulationsfaktor
zwischen den untersuchten Zuständen berechnet. Darüber hinaus wurde für
jedes Feature analog zum Verfahren in der 2D-DIGE-Analyse, ein p-Wert mit Hilfe
einer Varianzanalyse (One Way ANOVA) bestimmt. In einem nächsten Schritt wurden
vorhandene MS/MS-Daten für die Datenbanksuche in einen Mascot Generic File
(.mgf) exportiert und wie in Abschnitt 4.5.4 beschrieben eine Datenbanksuche mit den
Suchalgorithmen Mascot und X!Tandem durchgeführt. Nach erfolgter Validierung der
Suchergebnisse mittels der Software Scaffold (s. Abschnitt 4.5.4) wurden diese in Form
einer „Tab Delimited Textfile“ wieder in die Progenesis LC-MS Software importiert.
Durch die Identifizierungen konnten die einzelnen Features nun verschiedenen Peptiden
und damit Proteinen zugeordnet werden. Die Berechnung der Regulation und des
p-Wertes der einzelnen Proteine erfolgte analog zur Berechnung auf Peptidebene. Proteine
wurden als reguliert betrachtet, wenn sie mindestens 2-fach reguliert waren und
einen p-Wert < 0,05 aufwiesen. Die angelegten Kriterien für die Identifizierung eines
Peptids bzw. Proteins sind in Abschnitt 4.5.4 dargelegt.
4.5.3.2 Quantitative Analyse der 1D-Gel-Fraktionierungsdaten
Die in Abschnitt 4.3.4 erzeugten Proben wurden wie in 4.4.1 beschrieben über eine
1D-SDS-PAGE aufgetrennt und in zehn Fraktionen unterteilt. Da pro Zustand drei
biologische Replikate analysiert wurden, bestand jeder Versuch aus 60 einzelnen Fraktionen.
Diese wurden verdaut (s. Abschnitt 4.5.1) und wie in Abschnitt 4.5.3 beschrieben
mittels LC-ESI-MS/MS analysiert. Die quantitative Auswertung erfolgte mit der
Software Progenesis LC-MS. Dabei glich der Ablauf in weiten Teilen dem in Abschnitt
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