Dokument 2.pdf - OPUS-Datenbank - Universität Hohenheim

6.3 Vanillin
Fraktionierung (GeLCMSMS) den umfangreichsten Datensatz (Abschnitt 5.3.3).
Die im Folgenden diskutierten Ergebnisse beziehen sich daher, wenn nicht ausdrücklich
anders vermerkt, auf diese Methode. In Bezug auf den Abbau von Vanillin zeigte
sich sowohl im 2D-DIGE-Experiment als auch im GeLCMSMS-Experiment eine deutliche
Induktion der Proteine des Pca-Clusters (Abbildung 5.27). Hierbei wurden in der
GeLCMSMS-Analyse alle Proteine bis auf PcaC, welches allerdings in der 2D-DIGE-
Analyse induziert war, unter Vanillin verstärkt exprimiert. Auch VanA und VanB,
welche die Umwandlung von Vanillinsäure zu Protocatechuat katalysieren, waren deutlich
induziert. Diese Ergebnisse decken sich mit den von Kim et al. (2006) publizierten
Daten zum Abbau von Vanillin über die Vanillat-Demethylase und die Proteine des
Pca-Clusters. In den hier beschriebenen Experimenten konnten, im Gegensatz zu der
von Kim et al. (2006) durchgeführten Analyse, alle Enzyme des Pca-Weges sowie beide
Untereinheiten der Vanillat-Demethylase identifiziert werden. Zudem konnten verschiedene
am Metabolismus von Vanillin beteiligte Transportsysteme identifiziert werden.
Auf das Enzym Vanillin-Dehydrogenase (Vdh), welches mutmaßlich den ersten Schritt
des Vanillin-Abbaus darstellt und von Kim et al. (2006) nicht identifiziert wurde, wird
im folgenden Abschnitt im Detail eingegangen.
6.3.1 Vanillin-Dehydrogenase
Von besonderem Interesse im Hinblick auf eine biotechnologische Produktion von Vanillin,
ist das Enzym Vanillin-Dehydrogenase, welches den initialen Schritt des Vanillinabbaus
katalysiert. Aufgrund dieser Funktion wurde vermutet, dass durch einen
Knock-Out von vdh eine Akkumulation von Vanillin erreicht werden könnte. Im Rahmen
der GeLCMSMS-Analyse wurde das entsprechende Enzym zwar identifiziert, war
in Gegenwart von Vanillin allerdings nicht induziert. Auch die 2D-DIGE-Analyse, die
Metaboliten-Analyse sowie die Wachstumskurven der vdh-defizienten Mutante P. putida
GN235 lieferten keinen Hinweis auf eine kritische Rolle der Vanillin-Dehydrogenase
im Rahmen des Vanillin-Metabolismus. Obwohl die Metaboliten-Analyse zeigt, dass
zum Zeitpunkt der Probenahme (t=12 h, OD 600 = 0,6) kein Vanillin mehr im Überstand
nachweisbar war und somit eine zuvor induzierte Vdh zu diesem Zeitpunkt bereits
nicht mehr induziert sein könnte, spricht der Vergleich zwischen P. putida KT2440 und
GN235 gegen eine Schlüsselrolle der Vdh im Vanillin-Abbau.
Wahrscheinlich ist, dass ein oder mehrere Enzyme, welche diese Reaktion ebenfalls katalysieren,
die Funktion der Vanillin-Dehydrogenase in P. putida KT2440 ganz oder teilweise
ersetzen. Hierfür spricht auch, dass die Inaktivierung der Vanillin-Dehydrogenase
in verschiedenen Pseudomonaden unterschiedliche Folgen hat (Di Gioia et al., 2011).
Während die Inaktivierung des vdh-Gens in P. putida HR199 ein Wachstum auf Vanil-
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