Dokument 2.pdf - OPUS-Datenbank - Universität Hohenheim

4.5 Massenspektrometrie
4.5.6 Quantifizierung von Proteinen mittels SRM (Selected
Reaction Monitoring)
4.5.6.1 Probenvorbereitung
Im Rahmen dieser Analyse sollten die aus den 2D-DIGE-Experimenten erhaltenen Daten
überprüft werden (s. Abschnitt 5.5). Daher wurden für diesen Versuch die in 4.3.2
erwähnten Proben verwendet. Je 150 µg dieser Proben wurden mit 5 x Ladepuffer versetzt
und für 2 min bei 95 ◦ C inkubiert. Anschließend wurden die Proben auf ein 10%
Acrylamid-1D-SDS-Gel (s. Abschnitt 4.4.1) aufgetragen und bei 30 mA getrennt. Die
Elektrophorese wurde gestoppt, nachdem die Proben komplett in das Trenngel migriert
waren. Im Anschluss wurde die Probe wie in Abschnitt 4.5.1 beschrieben verdaut und
bis zur weiteren Verwendung bei -20 ◦ C gelagert.
4.5.6.2 SRM-Analyse und quantitative Auswertung
Wie bereits in der Einleitung beschrieben, werden in einem Protein-Spot einer 2D-
SDS-PAGE meist mehrere Proteine, teilweise mit einer ähnlichen Anzahl an Peptiden,
identifiziert. Daher lässt sich das eigentlich regulierte Protein häufig nicht zuverlässig
bestimmen.
Um zu validieren, welches der in einem Spot identifizierten Proteine tatsächlich das
regulierte Protein darstellt, wurden diese Proteine mittels SRM analysiert. In einem
ersten Schritt wurden aus den regulierten Proteinspots eines 2D-DIGE-Experiments
diejenigen ausgewählt, in welchen mehrere Proteine mit einer ähnlichen Anzahl an
Peptiden identifiziert wurden. Als Kontrolle bzw. Referenz wurden drei Proteine ausgewählt,
welche sich in nicht-regulierten Protein-Spots befanden und mit einer großen
Anzahl an Peptiden identifiziert worden waren (potentielle „Housekeeping Proteine“).
Um das SRM-Experiment vorzubereiten, wurden die Aminosäure-Sequenzen (FASTA)
der Proteine aus der NCBI-Datenbank in die Software MRM TM Pilot importiert und
auf geeignete proteotypische Peptide untersucht (MIDAS TM -Workflow). Hierzu wurden
die Proteine in silico verdaut und die erhaltenen Peptide nach mehreren Kriterien
gefiltert. Peptide welche eine Länge von 5 bis 15 Aminosäuren aufwiesen und
keine Methionine oder Cysteine enthielten, wurden als geeignet eingestuft, alle übrigen
Peptide wurden für die SRM-Analyse nicht berücksichtigt. Für jedes ausgewählte
Peptid wurden im Anschluss jeweils drei SRM-Übergänge von der Software kalkuliert
und diese in einem SRM-getriggerten MS/MS-Experiment überprüft. Hierzu wurden
die in Abschnitt 4.5.6.1 erzeugten Proben verwendet. Bei einem SRM-getriggerten
MS/MS-Experiment wird bei erfolgter Detektion eines SRM-Übergangs die Aufnahme
eines MS/MS-Spektrums ausgelöst. Um die zur Verfügung stehende Messzeit je
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