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4 Material und Methoden
geführten Versuchen identisch und wurde wie folgt bei 4 ◦ C durchgeführt. 50 ml der
Bakteriensuspension der Hauptkultur wurde in ein 50 ml Reaktionsgefäß überführt und
bei 3200 g für 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die verbliebene
Bakteriensuspension auf gleiche Weise behandelt. Das entstandene Bakterienpellet
wurde in 20 ml Waschpuffer resuspendiert, für 2 min auf Eis inkubiert und anschließend
erneut für 10 min bei 3200 g zentrifugiert. Dieser Waschschritt wurde mit 10 ml
Waschpuffer wiederholt. Anschließend wurde das Bakterienpellet in 1,5 ml Waschpuffer
aufgenommen, in ein 2 ml Reaktionsgefäß überführt und für 2 min bei 14.000 g zentrifugiert.
Der Überstand wurde verworfen und das Pellet bei -80 ◦ C bis zur weiteren
Verwendung gelagert.
4.2.3.1 Kultivierung der Zellen für die Analyse des Ethylenglycol- und
Glyoxylsäure-Metabolismus
Die in diesen Versuchen verwendeten Stämme (KT2440, GN187, GN259 und JM37)
wurden wie in Abschnitt 4.2.3 beschrieben aus einem Glycerolstock angezogen. Die
Vorkultur erfolgte in 20 ml LB-Medium bei 30 ◦ C und 180 rpm über Nacht. Vor der
Inokulation der Hauptkultur wurde die Vorkultur unter dem Mikroskop auf Kontaminationen
überprüft. Für die Hauptkultur wurden je 100 ml M12-BASF Medium in einem
500 ml Erlenmeyerkolben vorgelegt und mit 100 µl der Vorkultur inokuliert. Als einzige
Kohlenstoffquelle wurden dem Medium 10 mM Glucose zugesetzt. Nach 12 h Inkubation
bei 30 ◦ C und 180 rpm wurden jeweils drei Kolben mit 80 mM Ethylenglycol bzw.
10,8 mM Glyoxylsäure behandelt. Drei weitere Kolben dienten als Kontrolle und wurden
nicht behandelt. Nach weiteren 5 h Inkubation wurden die Zellen wie in Abschnitt
4.2.3 beschrieben geerntet. Die Kultivierung wurde gemeinsam mit Björn Mückschel
(AG Hauer, Institut für Technische Biochemie, Universität Stuttgart) durchgeführt.
4.2.3.2 Kultivierung der Zellen für die Analyse des Butanol-Metabolismus
In diesem Teilprojekt wurde ausschließlich der Stamm Pseudomonas putida KT2440
verwendet. Um eine Vergleichbarkeit zwischen den im Schüttelkolben und den im Fermenter
erhobenen Daten zu gewährleisten, erfolgte die Kultivierung der Proben in
M12-BVT anstelle von M12-BASF Medium. Beide Medien sind in Tabelle 4.6 beschrieben
und unterscheiden sich sowohl in der Konzentration der enthaltenen Salze als auch
in der Zusammensetzung der eingesetzten Spurenelementlösungen. Zudem wurden dem
M12-BASF Medium eine Vitaminlösung zugesetzt, welche das M12-BVT Medium nicht
enthielt.
Die Vorkultur erfolgte in 5 ml M12-BVT Medium (10 mM Glucose) bei 30 ◦ C und
180 rpm über Nacht. Für die Hauptkultur wurden 100 ml M12-BVT Medium (10 mM
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