Dokument 2.pdf - OPUS-Datenbank - Universität Hohenheim

6.4 Vergleich der eingesetzten Methoden
konnten lediglich 23 regulierte Proteine mit allen eingesetzten Methoden erfasst werden.
Die Unterschiede zwischen den Methoden lassen sich vor allem durch die Komplexität
der analysierten Proben erklären. Da nur eine gewisse Anzahl von Peptiden pro Zeiteinheit
massenspektrometrisch identifiziert bzw. quantifiziert werden kann, wurde in
allen Experimenten die Komplexität der Probe vor der LC-ESI-MS/MS-Analyse deutlich
reduziert. Dies wurde zum einen über gelbasierte Fraktionierung auf Proteinebene
(2D-DIGE, 1D-Fraktionierung) zum anderen durch chromatographische Trennung
der Peptide über lange RP-HPLC-Gradienten (Membranfraktion) erreicht. Von jedem
Trennverfahren werden identische Proteine bzw. Peptide unterschiedlich gut erfasst,
was sich auf die Wahrscheinlichkeit einer Identifizierung in der nachfolgenden massenspektrometrischen
Analyse auswirkt. Zudem gelangen trotz reduzierter Komplexität
pro Zeiteinheit mehr Peptide in das Massenspektrometer als analysiert werden können.
Besonders Peptide, welche nur in geringer Zahl vorliegen und somit eine geringe
Signal-Intensität aufweisen, werden häufig nicht reproduzierbar für eine Fragmentierung
ausgewählt und somit seltener identifiziert. Um einen möglichst großen Teil der
regulierten Proteine zu erfassen, erscheint es daher sinnvoll, mehrere Analysemethoden
zu kombinieren. Den besten Überblick über das Gesamtproteom liefert sicherlich
die GeLCMSMS-Analyse, welche allerdings auch die längste Analysezeit in Anspruch
nimmt.
Auffällig sind die teilweise deutlichen Unterschiede in den Regulationsfaktoren zwischen
2D-DIGE- und GeLCMSMS-Experimenten. Da es sich um unabhängige Methoden handelt,
sind deren Regulationsfaktoren nicht vergleichbar. Zudem geben die Werte in allen
eigesetzten Methoden nur ein relatives Verhältnis zwischen den untersuchten Zuständen
wieder.
Während die Quantifizierung in 2D-DIGE-Experimenten auf der Fluoreszenz der markierten
Proteine beruht, erfolgt die Quantifizierung in GeLCMSMS-Experimenten auf
Basis der beim Verdau erzeugter Peptide (mindesten zwei je Protein). In 2D-DIGE-
Experimenten haben alle Proteine eines Spots einen Einfluss auf den Regulationsfaktor,
da diese alle zur Fluoreszenz des Spots beitragen. Da sich bei der labelfreien Quantifizierung
der Regulationsfaktor eines Proteins aus den Regulationsfaktoren der detektierten
Peptide berechnet, nimmt mit der Zahl der identifizierten Peptide eines Proteins auch
die Präzision des Regulationsfaktors zu. Auch die Signalintensitäten der zur Quantifizierung
verwendeten „Features“ sowie deren reproduzierbare Detektion in den unterschiedlichen
biologischen Replikaten haben einen entscheidenden Einfluss auf den Regulationsfaktor
eines Proteins. Da sich neben diesen experimentellen Parametern auch die
Berechnung der Regulationsfaktoren zwischen den unterschiedlichen Methoden unterscheidet,
sollte die Größe der ermittelten Faktoren nicht als absolut angesehen werden.
Für eine präzisere Bestimmung der Regulationsfaktoren sei auf Methoden, welche die
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