Dokument 1.pdf - OPUS - Friedrich-Alexander-Universität Erlangen ...

Weitere Magazine

Empfehlungen

Info

I. 4. Material und Methoden aufgereinigt und in mit CIP (Invitrogen) dephosphorylierten, mit EcoRV (New England Biolabs) geöffneten Bluescript II KS Vektor ligiert (T4 DNA-Ligase, New England Biolabs). Erhaltene Klone wurden durch Kolonie-PCR, unter Verwendung einer Probe der Kolonie als DNA-Matrizen Quelle, mit vektorspezifischen Primern (5´- CTATGACCATGATTACGCCAAG-3´, 5´-TAACGCCAGGGTTTTCCCAGT-3´, 58 °C Annealingtemperatur) verifiziert und schließlich bei der Firma Seqlab (Göttingen) sequenziert. Primer wurden von Metabion (München) synthetisiert. 124 Ein weiteres nanos Fragment, inklusive aus RACE bekannter 5’ UTR Sequenz wurde in meiner Diplomarbeit kloniert (Länge: 631 bp), ein dritter Klon, ausschließlich kodierende Sequenz enthaltend wurde von Dr. Michael Schoppmeier zur Verfügung gestellt (Länge: 331 bp). DNA und Protein Sequenzanalysen, sowie Primerdesign wurden unter Zuhilfe- nahme von online-Datenbanken (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) und der folgen- den Programme durchgeführt: CLC Sequence Viewer, Oligo 4.05, ClustalX, DNASIS 2.0. 4.2. Expressionsanalysen Tribolium-Embryonen für Expressionsananalysen wurden, wenn nicht anders beschrieben, in 50 % Klorix für 2 mal 3 Minuten dechorionisiert, gespült, in einem Heptanbad aus dem Netzchen (180 !m) gesaugt und für 35 Minuten in 2 ml PEMS- Puffer, 6 ml Heptan und 350 !l 37% Formaldehydlösung fixiert. Nach der Fixierung wird die wässrige Phase entfernt und die Embryonen durch Zugabe von 8 ml Metha- nol und ca. 15 s starkes Schütteln devitellinisiert. Dadurch nicht devitellinisierte Embryonen können mehrmals durch eine 18g Kanüle gepresst werden um die noch verbliebene Vitellinhülle mechanisch zu entfernen. Vor allem Keimstreifstadien lassen sich schlecht devitellinisieren und werden durch diese Prozedur leicht zer- stört. Somit wurden Keimstreifembryonen, wenn nötig, nach der Fixierung von Hand aus der Eihülle präpariert. Hierzu werden die Embryonen einzeln aus der Heptan- phase auf doppelseitiges Klebeband (Tesa Photo Tape) gebracht, nach Verdunsten des Heptans mit DEPC-behandeltem PBS überschichtet und mit Hilfe von Minutien- nadeln aus der Eihülle präpariert. Danach werden die Embryonen so schnell wie möglich in Methanol überführt.
4.2.1. in situ Hybridisierung I. 4. Material und Methoden Die Synthese einzelsträngiger, Dig- bzw. Flu-markierter RNA-Sonden erfolgte durch T3 oder T7 Polymerase (Roche) im wesentlichen nach Standardprotokollen (Klingler und Gergen, 1993) mit aufgereinigten PCR-Produkten als Matrize (T3 bzw. T7 Primer, nach Stratagene; Quiagen MinElute PCR-Purification). Die Sonden werden nach der Präzipitation durch Ethanol und Ammoniumacetat, in 80 !l RNAse- freiem Wasser gelöst. In-situ-Hybridisierungen unter Verwendung dieser Sonden wurden ebenfalls nach Standardprotokollen durchgeführt (Tautz und Pfeifle, 1989; Prpic et al., 2001) und durch Alkalische Phophatase und !-Galactosidase Färbungen detektiert. Für in-situ-Hybridisierungen an Ovaren wurden adulte Weibchen in DEPC- behandeltem PBS präpariert und die Ovare in frischer, 4%iger Formaldehydlösung für 30 min bei 0°C fixiert. Die in-situ-Hybridisierung erfolgte im Wesentlichen wie für Embryonen beschrieben (Tautz und Pfeifle, 1989), allerdings wurde im Hybridisie- rungspuffer 2% Blocking Reagenz (Roche) und nach der Hybridisierung ein MABT Puffer (100 mM Maleinsäure, 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20, pH 7.5) verwendet. Um RNA-Expression für nanos nachzuweisen, wurden einige Veränderungen und Varianten des Standardprotokolls getestet. So wurden Sonden von allen verfüg- baren Fragmenten in unterschiedlichen Verdünnungen getestet (zwischen 0,01 !l und 5 !l Sonde pro 30 !l Hybridisierungspuffer). Sonden des 810 bp und des 631 bp Fragments wurden hydrolytisch verdaut und dann eingesetzt. Hierzu wurde präzipi- tierte Sonde in 25 !l 80 mM NaHCO3, 120 mM Na2CO3, pH 10,2 für 10 min bei 37°C hydrolysiert, die Reaktion mit 50 !l 200 mM C2H3NaO2, pH 6 beendet und die RNA durch Fällen von der Salzlösung gereinigt. Auf diese Art fragmentierte Sonden kön- nen die Signalstärke verbessern, da sie das Gewebe besser durchdringen (Wilkinson, 1998). Der Nachweis der 810 bp Sonde wurde auch unter Zuhilfenahme des Vectastain ABC Kits und des ABC-AP von Vector Labs, getestet. Ferner wurde die Verwendung einer Detergenzlösung (1% SDS, 0,5 % Tween, 1 mM EDTA, 50 mM TrisHCl pH 7,5, 150 mM NaCl) und alternativer Hybridisierungslösungen getestet. Außerdem wurden unterschiedlich stark fixierte (zwischen 30 min bei 4°C und mehreren Stunden bei Raumtemperatur) Embryonen mit dem Standardprotokoll getestet, die Sonden vor der Hybridisierung auf 95 °C erhitzt, um Sekundärstrukturen aufzulösen, und die Entwicklung der Färbung auch unter Verwendung von 5 % 125
Seite 1 und 2:
Die Funktion von Genen der posterio
Seite 3:
Danke! Obwohl als letztes verfasst,
Seite 6 und 7:
Inhaltsverzeichnis 2.4.1. Die Segme
Seite 8 und 9:
Inhaltsverzeichnis 3.1.2. Die Auswe
Seite 10 und 11:
Summary 2 Thus, I could show that a
Seite 12 und 13:
Zusammenfassung praktischen Durchf
Seite 14 und 15:
Abbildungsverzeichnis Abb. 24: Sche
Seite 16 und 17:
Abkürzungen Abkürzungen 8 AS: Ami
Seite 19 und 20:
Allgemeine Einleitung Allgemeine Ei
Seite 21 und 22:
Allgemeine Einleitung Tiere, hervor
Seite 23 und 24:
I. Kapitel: I. 1. Einleitung Die Fu
Seite 25 und 26:
I. 1. Einleitung 3; Davis und Patel
Seite 27 und 28:
I. 1. Einleitung 1.2. Drosophila me
Seite 29 und 30:
I. 1. Einleitung Butler, 1988). Int
Seite 31 und 32:
I. 1. Einleitung zur Phosphorylieru
Seite 33 und 34:
I. 1. Einleitung Gene ist in Tribol
Seite 35 und 36:
I. 1. Einleitung Die frühe Regulat
Seite 37 und 38:
I. 1. Einleitung wahrscheinlich üb
Seite 39 und 40:
I. 1. Einleitung wie in Vertebraten
Seite 41 und 42:
I. 1. Einleitung und Wharton, 1999)
Seite 43 und 44:
I. 1. Einleitung des nanos-Verlusts
Seite 45 und 46:
I. 1. Einleitung Außerdem zeigen n
Seite 47 und 48:
1.5. Ziele des ersten Kapitels der
Seite 49 und 50:
2. Ergebnisse I. 2. Ergebnisse 2.1.
Seite 51 und 52:
I. 2. Ergebnisse Abb. 6: Sequenzver
Seite 53 und 54:
I. 2. Ergebnisse Domäne vermittelt
Seite 55 und 56:
2.2.2. nanos-Expression ist nur in
Seite 57 und 58:
I. 2. Ergebnisse 2.3. pRNAi für na
Seite 59 und 60:
I. 2. Ergebnisse einerseits, dass d
Seite 61 und 62:
I. 2. Ergebnisse des Kopfes. Außer
Seite 63 und 64:
I. 2. Ergebnisse Doppel-RNAi in ver
Seite 65 und 66:
I. 2. Ergebnisse 2.4. Frühembryona
Seite 67 und 68:
I. 2. Ergebnisse nächst ist zu beo
Seite 69 und 70:
I. 2. Ergebnisse 61
Seite 71 und 72:
I. 2. Ergebnisse Domäne. Diese ble
Seite 73 und 74:
I. 2. Ergebnisse 65
Seite 75 und 76:
I. 2. Ergebnisse terminaler Zielgen
Seite 77 und 78:
I. 2. Ergebnisse Tatsächlich fehle
Seite 79 und 80:
I. 2. Ergebnisse Abb. 15: nos/pum-R
Seite 81 und 82: I. 2. Ergebnisse Expression auf die
Seite 83 und 84: I. 2. Ergebnisse 2.7. Die Beteiligu
Seite 85 und 86: 2.7.1. Tribolium brain-tumor I. 2.
Seite 87 und 88: I. 2. Ergebnisse 2.7.3. brat-RNAi f
Seite 89 und 90: I. 2. Ergebnisse kulas somit interm
Seite 91 und 92: Abb. 19: brain-tumor-RNAi führt zu
Seite 93 und 94: I. 2. Ergebnisse Keimbahn in Verbin
Seite 95 und 96: I. 2. Ergebnisse 2.8.3. pumilio spi
Seite 97 und 98: I. 2. Ergebnisse Präpuppe, deren M
Seite 99 und 100: 3. Diskussion I. 3. Diskussion 3.1.
Seite 101 und 102: I. 3. Diskussion mann, 1998; Asaoka
Seite 103 und 104: I. 3. Diskussion leider nicht gepr
Seite 105 und 106: I. 3. Diskussion Möglicherweise ve
Seite 107 und 108: I. 3. Diskussion Marques-Souza et a
Seite 109 und 110: I. 3. Diskussion der antennalen Seg
Seite 111 und 112: I. 3. Diskussion Effekt, der erst i
Seite 113 und 114: I. 3. Diskussion Netzwerk, das zur
Seite 115 und 116: I. 3. Diskussion gerufene Vernetzun
Seite 117 und 118: I. 3. Diskussion Natürlich gibt es
Seite 119 und 120: I. 3. Diskussion 3.4. Das Zusammens
Seite 121 und 122: I. 3. Diskussion sion als Substrat
Seite 123 und 124: I. 3. Diskussion ren gt-Domäne üb
Seite 125 und 126: I. 3. Diskussion Außerdem hat otd-
Seite 127 und 128: I. 3. Diskussion on eines von Fakto
Seite 129 und 130: I. 3. Diskussion jeweiligen ersten
Seite 131: 4. Material und Methoden I. 4. Mate
Seite 135 und 136: I. 4. Material und Methoden ohne Bl
Seite 137: Tab. 6: Primer für dsRNA Matrize I
Seite 140 und 141: II. 1. Einleitung 132 In Anlehnung
Seite 142 und 143: II. 1. Einleitung Entwicklung. Dabe
Seite 144 und 145: II. 1. Einleitung 1.3. RNAi-Screens
Seite 146 und 147: II. 1. Einleitung Serie zu beobacht
Seite 148 und 149: II. 1. Einleitung 140 schen Fragest
Seite 150 und 151: II. 1. Einleitung Augen und im zent
Seite 152 und 153: II. 1. Einleitung 1.4.3. Die iBeetl
Seite 154 und 155: II. 1. Einleitung sophila wegen tec
Seite 156 und 157: II. 1. Einleitung 1.5. Ziele des zw
Seite 158 und 159: II. 2. Ergebnisse nale Musterbildun
Seite 160 und 161: II. 2. Ergebnisse 152 Im nächsten
Seite 162 und 163: II. 2. Ergebnisse bei 30°C inkubie
Seite 164 und 165: II. 2. Ergebnisse 1999a) 156 Auch d
Seite 166 und 167: II. 2. Ergebnisse lichst effektiv z
Seite 168 und 169: II. 2. Ergebnisse 160
Seite 170 und 171: II. 2. Ergebnisse 162
Seite 172 und 173: II. 2. Ergebnisse Abb. 29: Arbeitsp
Seite 174 und 175: II. 2. Ergebnisse Ergebnisse der Po
Seite 176 und 177: II. 2. Ergebnisse von RNAi-Effekten
Seite 178 und 179: II. 2. Ergebnisse 2.3. Es konnten f
Seite 180 und 181: II. 2. Ergebnisse Abb. 32: Zusammen
Seite 182 und 183:
II. 2. Ergebnisse Abb. 33: Defekte
Seite 184 und 185:
II. 2. Ergebnisse zu trennen. So k
Seite 186 und 187:
II. 2. Ergebnisse 2.3.2. Defekte w
Seite 188 und 189:
II. 2. Ergebnisse Abb. 35: Morpholo
Seite 190 und 191:
II. 2. Ergebnisse diesen Phänotype
Seite 192 und 193:
II. 2. Ergebnisse 184
Seite 194 und 195:
II. 2. Ergebnisse Abb. 37: In adult
Seite 196 und 197:
II. 2. Ergebnisse Abb. 38: Bisher u
Seite 198 und 199:
II. 3. Diskussion des ersten Jahres
Seite 200 und 201:
II. 3. Diskussion analysiert werden
Seite 202 und 203:
II. 3. Diskussion Meinung, dass der
Seite 204 und 205:
II. 3. Diskussion jeweils zu Beginn
Seite 206 und 207:
II. 3. Diskussion nach den gleichen
Seite 208 und 209:
II. 3. Diskussion in Tribolium, nic
Seite 210 und 211:
II. 3. Diskussion 1980). Bei der Ka
Seite 212 und 213:
II. 3. Diskussion phänotypische Hi
Seite 214 und 215:
II. 3. Diskussion 3.2.6. iBeetle ha
Seite 216 und 217:
II. 3. Diskussion Prozesse der Inse
Seite 218 und 219:
II. 4. Material und Methoden Phenol
Seite 220 und 221:
II. 4. Material und Methoden pigmen
Seite 222 und 223:
II. 4. Material und Methoden 214 Em
Seite 224 und 225:
II. 4. Material und Methoden bei de
Seite 226 und 227:
II. 4. Material und Methoden 218 Ti
Seite 229 und 230:
Allgemeine Diskussion Allgemeine Di
Seite 231:
Allgemeine Diskussion und Achsendet
Seite 234 und 235:
Anhang ACCCATCCGTACGGCTGCCGGGTCATTC
Seite 236 und 237:
Anhang 2. Ergänzende Ergebnisse zu
Seite 238 und 239:
Anhang 3. Zeitaufwand der iBeetle-A
Seite 240 und 241:
Anhang 5. Zusammenfassung der Ergeb
Seite 242 und 243:
234 134 900 14 similar to D123 (cdc
Seite 244 und 245:
236 77 1500 57 gene without homolog
Seite 246 und 247:
238 43 1000 99 similar to Rab-prote
Seite 248 und 249:
Anhang gemischt embryonal letal von
Seite 250 und 251:
Literatur Literatur Abdel-Latief, M
Seite 252 und 253:
Literatur Bernstein, D., Hook, B.,
Seite 254 und 255:
Literatur Ciglar, L. und Furlong, E
Seite 256 und 257:
Literatur Falciani, F., Hausdorf, B
Seite 258 und 259:
Literatur Gutjahr, T., Vanario-Alon
Seite 260 und 261:
Literatur Kiger, A. A., Baum, B., J
Seite 262 und 263:
Literatur Lin, H. und Spradling, A.
Seite 264 und 265:
Literatur binding protein that phys
Seite 266 und 267:
Literatur Riddiford, L. M., Hiruma,
Seite 268 und 269:
Literatur Schüpbach, T. und Wiesch
Seite 270 und 271:
Literatur Tomoyasu, Y., Miller, S.
Seite 272:
Literatur Zhang, X. D. und Heyse, J
Alle anzeigen

Dokument 1.pdf - OPUS - Friedrich-Alexander-Universität Erlangen ...

Sie wollen auch ein ePaper? Erhöhen Sie die Reichweite Ihrer Titel.

Template löschen?

Als Template speichern?