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I. 4. Material und Methoden
gespleißter Fragmente durch Agarose-Geleelektrophorese erschweren, weshalb
diese Stragtegie gewählt wurde. Die Amplifikation genomischer Fragmente aufgrund
von verunreinigten Reagenzien wurde außerdem durch Kontrollreaktionen ausge-
schlossen (Reaktionsansätze ohne Reverse Transkriptase, bzw. ohne RNA Matrit-
ze).
Tab. 5: Primer und Bedingungen der RT-PCR
Primer Annealing- Zyklen Fragment-
nanos
temperaturlänge fw 5’-ACGTGCTCAAATGTCTTTC-3’
bw 5’-GTGGTTGATAAATTTGGTCG-3’ 50 °C 34 450 bp
rp49 Verändert nach (Konopova und Jindra,
2007)
fw 5’-ATGGCAAACTCAAACGCAAC-3’
bw 5’-TAGCATGTGCTTCGTTTTGG-3’ 50 °C 24 132 bp
4.3. RNAi-Experimente
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RNAi Injektionen von Tribolium Puppen, ebenso wie embryonale, larvale und a-
dulte RNAi-Experimente wurden im Wesentlichen wie beschrieben durchgeführt
(Bucher et al., 2002; Brown et al., 1999b; Tomoyasu und Denell, 2004; van der Zee
et al., 2006). Die hier gezeigten Ergebnisse stammen, falls nicht anders ausgewie-
sen, aus pupalen RNAi-Experimenten.
Für die Synthese der Kontroll-RNA gegen DS-Red wurde eine DNA-Matrize
durch PCR hergestellt. Hierzu wurden genspezifische Primer mit zusätzlichen T7-
RNA-Polymerase Promoter-Sequenzen verwendet. Das DS-Red Fragment wurde
von pSLfa[Tc’hsp5’-dsRedEx-3’UTR] (Johannes Schinko, Göttingen) amplifiziert.
Auch von nanos und pumilio wurden DNA-Matrizen durch PCR, unter Verwendung
des T7-Primers und eines T3-Primers ebenfalls mit zusätzlicher T7-
Promotorsequenz, hergestellt. Aufgereinigte PCR Produkte (MinElute PCR Purificati-
on, Quiagen) wurden zu RNA-Synthese mit MEGAscript T7 Kits (Ambion) verwendet.
dsRNAs wurden in Injektionspuffer (1,4 mM NaCl, 0,07 mM Na2HPO4, 0,03 mM
KH2PO4, 4 mM KCL) gelöst.