Dokument 1.pdf - OPUS - Friedrich-Alexander-Universität Erlangen ...

2.2.2. nanos-Expression ist nur in vitro nachweisbar
I. 2. Ergebnisse
Trotz intensiver Bemühungen konnte ich nanos-mRNA-Expression nicht durch
das standardmäßige in situ-Hybridisierungs-Protokoll nachweisen. Auch unterschied-
lichste Variationen der Methode, wie die Verwendung unterschiedlicher Genfragmen-
te als Matrize für die Sondensynthese, hydrolytisch fragmentierte Sonden, stärke-
re/schwächere Fixierungen, Amplifikationsschritte und unterschiedliche Detektions-
methoden führten zu keinem spezifischen Nachweis (vgl. 4.2). Der Vergleich mit
Embryonen, die nicht mit Sonde behandelt, oder mit der sense-Sonde inkubiert
wurden zeigt, dass eine sehr spät einsetzende Färbung in Dotter und embryonalen
Geweben als unspezifische Hintergrungfärbung zu werten ist (nicht gezeigt). Das
Vorhandensein schwacher, ubiquitärer Expression auf dem Niveau des Hintergrund-
signals kann allerdings nicht vollständig ausgeschlossen werden. Ein Polyklonales
Kaninchenserum gegen zwei Peptide des Tribolium NANOS-Proteins (produziert von
der Firma Eurogentec, Köln, Deutschland/Seraing, Belgien) waren nach umfangrei-
chen Tests ebenfalls nicht geeignet, um die Expression von NANOS-Protein in situ
oder auch im Western-Blot zu detektieren. Im Gegensatz zu diesen Methoden war es
allerdings möglich, die Expression von nanos-mRNA in vitro nachzuweisen (Abb. 8).
Durch eine RT-PCR Strategie mit exonischen Primern und verschiedenen cDNAs als
Matritzen (vgl. 4.2.3) konnte ich zeigen, dass nanos über alle getesteten Entwick-
lungsstadien hinweg exprimiert wird. Der Nachweis in unbefruchteten Eiern (Abb. 8,
B, Ansatz 1) zeigt das Vorhandensein maternaler RNA in den Oozyten. Während der
ersten 30 Stunden der Embryonalentwicklung bleibt nanos dann durchgehend kon-
stant exprimiert (Abb. 8, A). Auch in späteren Entwicklungsstadien, also sowohl in
larvalen, pupalen und adulten Tieren, ist mRNA-Expression nachweisbar (Abb. 8, B).
Dies könnte sowohl mit einer Funktion für die Entwicklung und Funktion der Gona-
den, als auch mit einer Rolle für die Entwicklung und Aktivität peripherer Neuronen in
Zusammenhang stehen. Beide Funktionszusammenhänge sind bei Drosophila
bekannt (siehe Einleitung; Kobayashi et al., 1996; Forbes und Lehmann, 1998;
Schweers et al., 2002; Dubnau et al., 2003; Wang und Lin, 2004; Ye et al., 2004).
Eine Quantifizierung der vorhandenen mRNA erlaubt diese Methode allerdings nicht.
Stärkere Signale können zwar ein Hinweis auf eine erhöhte Expression sein, könnten
aber auch auf Schwankungen der Templatequalität zurückzuführen sein.
Obwohl das Vorhandensein der nanos-mRNA in vitro zweifelsfrei gezeigt werden
konnte, war es nicht möglich die räumliche Verteilung in whole mount Färbungen
47