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I. 4. Material und Methoden Polyvinylalkohol durchgeführt. Keine dieser Variationen führten zu einem spezifi- schen Nachweis der nanos-Expression. 4.2.2. Antikörperproduktion und Immunohistochemische Färbungen 126 Zum Nachweis der nanos-Expression in situ wurden von der Firma Eurogentec Polyklonale Seren gegen in vitro synthetisierte NANOS Peptide hergestellt. Eurogen- tec hat dabei zwei kurze Peptide der NANOS-Proteinsequenz synthetisiert (H2N- QNQQFSQDVENYQRPC-CONH2 und H2N-RNQQFSNVLRSIENVQC-CONH2) die von Fachleuten dort ausgewählt wurden, und eine möglichst hohe Wahrscheinlichkeit für die Erkennung der Epitope des nativen Proteins durch das polyklonale Serum gewährleisten sollen. Mit einer Mischung beider Peptide wurden zwei Kaninchen immunisiert, die anhand des Verhaltens ihrer Präimmunseren in Testfärbungen von mir aus fünf Tieren ausgewählt wurden. Unter Berücksichtigung der Ergebnisse weiterer von mir durchgeführter Testfärbungen während des Immunisierungspro- gramms, wurden insgesamt sechs Injektionen durchgeführt. Die zweite zwei Wochen nach der ersten Injektion, jede weitere im Abstand eines Monats. 20 ml der Immun- seren der finalen Blutungen beider Kaninchen wurden vereinigt, und mittels Affini- tätschromatographie getrennt gegen beide Peptide von Eurogentec aufgereinigt und mir zur Verfügung gestellt. Die polyklonalen Immunseren wurden in whole-mount Immunhistochemischen Färbungen an Tribolium und Drosophila Embryonen unter- schiedlichen Alters auf ihre Reaktivität getestet. Es war leider nicht möglich durch diese Experimente NANOS-Protein nachzuweisen. Die Polyklonalen Immunseren konnten zwar verwendet werden um die an Carrier-Protein gebundenen Peptide zu detektieren, es konnte aber auch durch Western-Blot verschiedener Tribolium- Proteinextrakte kein NANOS-Protein nachgewiesen werden. Vorhandene Polyklona- le Seren gegen OTD-1 oder CAD hingegen (Schulz et al., 1998; Schröder, 2003), konnten in Western-Blots erfolgreich zum Nachweis ihrer Zielproteine eingesetzt werden. Zum Nachweis des NANOS-Proteins in whole mount Färbungen mit Tribolium Embryonen wurden diverse Variationen des Standardprotokolls für Immunhistoche- mische Färbungen getestet (Roth et al., 1989). Zunächst wurden Verdünnungen der Seren zwischen 1:10 und 1:200 getestet. Die Seren wurden mit Tribolium Embryo- nen präabsorbiert. Die Stärke der Blocking-Schritte wurde zwischen 20 min bis 2 h mit 3% BSA, 1h mit 8% BSA, 30 min mit 0,5 % Böhringer Blocking Reagenz und
I. 4. Material und Methoden ohne Blocking Schritt variiert. Abweichend von der Standard Fixierung wurden kürze- re und längere Fixationszeiten (15 min, 90 min), Devitellinisierung mit Ethanol statt Methanol, Devitellinisierung von Hand unter Vermeidung von Alkoholen und Hitzefi- xierung (Sullivan et al., 2000) angewandt. Zur Detektion wurde Alkalische Phospha- tase, Peroxidase unter Verwendung eines Amplifikationsschritts durch das Vec- tastain ABC System (Vectorlabs) und Immunfluoreszenz (Anti-Rabbit-Cy3) verwendet. Außerdem wurde durch Behandlung mit Isopropanol, oder Xylol und Aceton vor Zugabe des Erstantikörpers versucht das Ergebnis zu verbessern. Schließlich wurden die Seren auch auf ihre Reaktivität in Tribolium Ovaren und Drosophila Embryo- nen getestet. Alle diese Experimente führten zur gleichen, unregelmäßigen Hintergrundfär- bung. Marginale Unterschiede waren in einzelnen Ansätzen zu beobachten, in kei- nem wurde ein qualitativ unterschiedliches Ergebnis erreicht. Tab. 4: Verwendete Erst- und Zweitantikörper Antikörper Hersteller/Referenz Verdünnung Rabbit-Anti-Tc-OTD (Schröder, 2003) 1:100 Rabbit-Anti-Tc-CAD (Schulz et al., 1998) 1:50 Mouse-Anti-!-TUBULIN Sigma 1:500 Anti-DIG-AP (Fab) Roche 1:2000 Anti-DIG-Pod (Fab) Roche 1:2000 Anti-Flu-AP (Fab) Roche 1:2000 Goat-Anti-Rabbit-Bio Vector Laboratories 1:200 Goat-Anti-Rabbit-Cy3 Jackson Immuno Research 1:100 Rabbit-Anti-Mouse-Cy2 Rockland 1:50 4.2.3. Qualitative RT-PCR Zum Nachweis der nanos-Expression in vitro wurde RT-PCR mit unterschiedli- chen cDNAs als Matrize durchgeführt. RNAs wurden aus 3 Tieren bzw. ca. 50 !l Embryonen unter Verwendug von TRIzol (Invitrogen) extrahiert, mit DNAse inkubiert und nochmals durch TRIzol gereinigt. RNAs wurden Spektralphotometrisch vermes- sen und 1,5 !g jeder Extraktion für die cDNA Synthese eingesetzt (Transcriptor High Fidelity cDNA Synthsis Kit, Roche). 0,5 !l cDNA wurde für PCR-Reaktionen verwendet. Der Nachweis von nanos und der mRNA des ribosomalen Proteins rp49 erfolgte durch Verwendung von Primerpaaren, deren „forward“-Primer auf einer Exon-Grenze liegen und somit die Amplifikation von genomischer DNA vermeiden. Das kleine Intron des nanos Gens (49 bp) könnte eine Unterscheidung genomischer und 127
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Die Funktion von Genen der posterio
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Danke! Obwohl als letztes verfasst,
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Inhaltsverzeichnis 2.4.1. Die Segme
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Inhaltsverzeichnis 3.1.2. Die Auswe
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Summary 2 Thus, I could show that a
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Zusammenfassung praktischen Durchf
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Abbildungsverzeichnis Abb. 24: Sche
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Abkürzungen Abkürzungen 8 AS: Ami
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Allgemeine Einleitung Allgemeine Ei
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Allgemeine Einleitung Tiere, hervor
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I. Kapitel: I. 1. Einleitung Die Fu
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I. 1. Einleitung 3; Davis und Patel
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I. 1. Einleitung 1.2. Drosophila me
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I. 1. Einleitung Butler, 1988). Int
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I. 1. Einleitung zur Phosphorylieru
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I. 1. Einleitung Gene ist in Tribol
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I. 1. Einleitung Die frühe Regulat
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I. 1. Einleitung wahrscheinlich üb
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I. 1. Einleitung wie in Vertebraten
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I. 1. Einleitung und Wharton, 1999)
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I. 1. Einleitung des nanos-Verlusts
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I. 1. Einleitung Außerdem zeigen n
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1.5. Ziele des ersten Kapitels der
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2. Ergebnisse I. 2. Ergebnisse 2.1.
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I. 2. Ergebnisse Abb. 6: Sequenzver
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I. 2. Ergebnisse Domäne vermittelt
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2.2.2. nanos-Expression ist nur in
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I. 2. Ergebnisse 2.3. pRNAi für na
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I. 2. Ergebnisse einerseits, dass d
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I. 2. Ergebnisse des Kopfes. Außer
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I. 2. Ergebnisse Doppel-RNAi in ver
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I. 2. Ergebnisse nächst ist zu beo
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I. 2. Ergebnisse Abb. 15: nos/pum-R
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II. 3. Diskussion Prozesse der Inse
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II. 4. Material und Methoden bei de
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II. 4. Material und Methoden 218 Ti
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Allgemeine Diskussion Allgemeine Di
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Allgemeine Diskussion und Achsendet
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Anhang ACCCATCCGTACGGCTGCCGGGTCATTC
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Anhang 2. Ergänzende Ergebnisse zu
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Anhang 3. Zeitaufwand der iBeetle-A
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234 134 900 14 similar to D123 (cdc
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238 43 1000 99 similar to Rab-prote
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Anhang gemischt embryonal letal von
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Literatur Literatur Abdel-Latief, M
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Literatur Bernstein, D., Hook, B.,
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Literatur Ciglar, L. und Furlong, E
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Literatur Falciani, F., Hausdorf, B
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Literatur Gutjahr, T., Vanario-Alon
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Literatur Kiger, A. A., Baum, B., J
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Literatur Lin, H. und Spradling, A.
Seite 264 und 265:
Literatur binding protein that phys
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Literatur Riddiford, L. M., Hiruma,
Seite 268 und 269:
Literatur Schüpbach, T. und Wiesch
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Literatur Tomoyasu, Y., Miller, S.
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Literatur Zhang, X. D. und Heyse, J
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