Dokument 1.pdf - OPUS - Friedrich-Alexander-Universität Erlangen ...
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II. 4. Material und Methoden<br />
Bei sehr wenigen Eiern wird ein Quetschpräparat hergestellt, wenn viele schlupf-<br />
reife Larven sichtbar sind. Bei vielen scheinbar unentwickelten Eiern wird nicht<br />
gequetscht. Die Präparate werden über Nacht bei 60°C inkubiert.<br />
8) Auswertung der Kutikulapräparate<br />
Die Auswertung der Präparate am Fluoreszenz-Mikroskop erfolgt zu unterschied-<br />
lichen Zeitpunkten. Verwendet wird ein YFP-Filter und eine Dunkelfeldeinstellung des<br />
Mikroskops. Die Präparate werden zunächst unter Verwendung eines 10fach Objek-<br />
tivs in horizontalen Linien „gescannt“. Dabei wird auf deutliche Veränderungen der<br />
Morphologie und die Zahl an nicht-entwickelten Embryonen geachtet. Hierfür emp-<br />
fiehlt sich die Dunkelfeldeinstellung. Anhand des Dotters sind dann nicht entwickelte<br />
Eier gut von leeren Eihüllen (Larve geschlüpft) zu unterscheiden. Defekte werden bei<br />
höherer Vergrößerung (20fach - 40fach Objektiv) analysiert und charakterisiert, um<br />
dann ihre Häufigkeit zu bestimmen. Werden keine deutlichen Veränderungen festge-<br />
stellt, werden ca. 25 % der Larven, mindestens aber fünf Tiere, im Detail (20fach -<br />
40fach Objektiv) auf subtile Veränderungen der Morphologie (va. Kopfborstenmuster,<br />
Mundwerkzeuge, Beine) untersucht.<br />
! Festhalten und <strong>Dokument</strong>ation von Veränderungen der Eiform und -größe.<br />
! Festhalten des Anteils nicht-entwickelter Eier.<br />
! Festhalten und <strong>Dokument</strong>ation morphologischer Veränderungen, also embry-<br />
onaler Phänotypen, und deren Häufigkeit.<br />
(H) Die zu screenenden morphologischen Aspekte sollen zur Orientierung der<br />
Screener auf einer „Screening-Tafel“ zusammengefasst sein.<br />
9) Lebendpräparate herstellen und auswerten (Tag 14)<br />
Nach 72-stündiger Inkubation Embryonen und geschlüpfte Larven umschütten<br />
und dechorionisieren wie in Schritt 7 beschrieben. Mit einem Pinsel je die Hälfte der<br />
Eier und Larven eines Geleges in je einen Tropfen Voltaleföl (10s) auf einem Objekt-<br />
träger überführen, und die eine Hälfte als Quetschpräparat (siehe Schritt 7) die<br />
andere Hälfte ungequetscht einbetten. Bei wenigen Eiern/Tieren zunächst nicht<br />
quetschen, gegebenenfalls nach einer ersten Inspektion noch quetschen.<br />
Die Auswertung am Fluzoreszenz-Mikroskop muss am gleichen Tag durchgeführt<br />
werden. Zur Analyse eines Injektionsblocks von 30 Injektionen muss der Screener<br />
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