Dokument 1.pdf - OPUS - Friedrich-Alexander-Universität Erlangen ...

4.2.1. in situ Hybridisierung
I. 4. Material und Methoden
Die Synthese einzelsträngiger, Dig- bzw. Flu-markierter RNA-Sonden erfolgte
durch T3 oder T7 Polymerase (Roche) im wesentlichen nach Standardprotokollen
(Klingler und Gergen, 1993) mit aufgereinigten PCR-Produkten als Matrize (T3 bzw.
T7 Primer, nach Stratagene; Quiagen MinElute PCR-Purification). Die Sonden wer-
den nach der Präzipitation durch Ethanol und Ammoniumacetat, in 80 !l RNAse-
freiem Wasser gelöst. In-situ-Hybridisierungen unter Verwendung dieser Sonden
wurden ebenfalls nach Standardprotokollen durchgeführt (Tautz und Pfeifle, 1989;
Prpic et al., 2001) und durch Alkalische Phophatase und !-Galactosidase Färbungen
detektiert.
Für in-situ-Hybridisierungen an Ovaren wurden adulte Weibchen in DEPC-
behandeltem PBS präpariert und die Ovare in frischer, 4%iger Formaldehydlösung
für 30 min bei 0°C fixiert. Die in-situ-Hybridisierung erfolgte im Wesentlichen wie für
Embryonen beschrieben (Tautz und Pfeifle, 1989), allerdings wurde im Hybridisie-
rungspuffer 2% Blocking Reagenz (Roche) und nach der Hybridisierung ein MABT
Puffer (100 mM Maleinsäure, 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20, pH 7.5) verwendet.
Um RNA-Expression für nanos nachzuweisen, wurden einige Veränderungen
und Varianten des Standardprotokolls getestet. So wurden Sonden von allen verfüg-
baren Fragmenten in unterschiedlichen Verdünnungen getestet (zwischen 0,01 !l
und 5 !l Sonde pro 30 !l Hybridisierungspuffer). Sonden des 810 bp und des 631 bp
Fragments wurden hydrolytisch verdaut und dann eingesetzt. Hierzu wurde präzipi-
tierte Sonde in 25 !l 80 mM NaHCO3, 120 mM Na2CO3, pH 10,2 für 10 min bei 37°C
hydrolysiert, die Reaktion mit 50 !l 200 mM C2H3NaO2, pH 6 beendet und die RNA
durch Fällen von der Salzlösung gereinigt. Auf diese Art fragmentierte Sonden kön-
nen die Signalstärke verbessern, da sie das Gewebe besser durchdringen
(Wilkinson, 1998). Der Nachweis der 810 bp Sonde wurde auch unter Zuhilfenahme
des Vectastain ABC Kits und des ABC-AP von Vector Labs, getestet. Ferner wurde
die Verwendung einer Detergenzlösung (1% SDS, 0,5 % Tween, 1 mM EDTA, 50
mM TrisHCl pH 7,5, 150 mM NaCl) und alternativer Hybridisierungslösungen getes-
tet. Außerdem wurden unterschiedlich stark fixierte (zwischen 30 min bei 4°C und
mehreren Stunden bei Raumtemperatur) Embryonen mit dem Standardprotokoll
getestet, die Sonden vor der Hybridisierung auf 95 °C erhitzt, um Sekundärstrukturen
aufzulösen, und die Entwicklung der Färbung auch unter Verwendung von 5 %
125