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I. 4. Material und Methoden
Polyvinylalkohol durchgeführt. Keine dieser Variationen führten zu einem spezifi-
schen Nachweis der nanos-Expression.
4.2.2. Antikörperproduktion und Immunohistochemische Färbungen
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Zum Nachweis der nanos-Expression in situ wurden von der Firma Eurogentec
Polyklonale Seren gegen in vitro synthetisierte NANOS Peptide hergestellt. Eurogen-
tec hat dabei zwei kurze Peptide der NANOS-Proteinsequenz synthetisiert (H2N-
QNQQFSQDVENYQRPC-CONH2 und H2N-RNQQFSNVLRSIENVQC-CONH2) die
von Fachleuten dort ausgewählt wurden, und eine möglichst hohe Wahrscheinlichkeit
für die Erkennung der Epitope des nativen Proteins durch das polyklonale Serum
gewährleisten sollen. Mit einer Mischung beider Peptide wurden zwei Kaninchen
immunisiert, die anhand des Verhaltens ihrer Präimmunseren in Testfärbungen von
mir aus fünf Tieren ausgewählt wurden. Unter Berücksichtigung der Ergebnisse
weiterer von mir durchgeführter Testfärbungen während des Immunisierungspro-
gramms, wurden insgesamt sechs Injektionen durchgeführt. Die zweite zwei Wochen
nach der ersten Injektion, jede weitere im Abstand eines Monats. 20 ml der Immun-
seren der finalen Blutungen beider Kaninchen wurden vereinigt, und mittels Affini-
tätschromatographie getrennt gegen beide Peptide von Eurogentec aufgereinigt und
mir zur Verfügung gestellt. Die polyklonalen Immunseren wurden in whole-mount
Immunhistochemischen Färbungen an Tribolium und Drosophila Embryonen unter-
schiedlichen Alters auf ihre Reaktivität getestet. Es war leider nicht möglich durch
diese Experimente NANOS-Protein nachzuweisen. Die Polyklonalen Immunseren
konnten zwar verwendet werden um die an Carrier-Protein gebundenen Peptide zu
detektieren, es konnte aber auch durch Western-Blot verschiedener Tribolium-
Proteinextrakte kein NANOS-Protein nachgewiesen werden. Vorhandene Polyklona-
le Seren gegen OTD-1 oder CAD hingegen (Schulz et al., 1998; Schröder, 2003),
konnten in Western-Blots erfolgreich zum Nachweis ihrer Zielproteine eingesetzt
werden.
Zum Nachweis des NANOS-Proteins in whole mount Färbungen mit Tribolium
Embryonen wurden diverse Variationen des Standardprotokolls für Immunhistoche-
mische Färbungen getestet (Roth et al., 1989). Zunächst wurden Verdünnungen der
Seren zwischen 1:10 und 1:200 getestet. Die Seren wurden mit Tribolium Embryo-
nen präabsorbiert. Die Stärke der Blocking-Schritte wurde zwischen 20 min bis 2 h
mit 3% BSA, 1h mit 8% BSA, 30 min mit 0,5 % Böhringer Blocking Reagenz und