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II. 3. Diskussion
Verwendung der gleichen Promotoren für die RNA-Synthese und die vorherige
Amplifikation der Matrizen erlangt der letzte Punkt besondere Bedeutung.
Eine Beobachtung während der Durchführung des Pilot-Screens verdeutlicht die
Wichtigkeit dieser Qualitätskontrollen. Die dort verwendeten dsRNAs wurden auf
Basis von PCR-Produkten hergestellt, die Amplifikate der Inserts zufällig gewählter
Klone einer embryonalen cDNA-Bank repräsentierten (4.1). Sieben dieser dsRNAs
konnten nicht in die Auswertung einbezogen werden. In diesen Fällen führte eine
Verunreinigung mit einem hunchback-Fragment unbekannter Herkunft zu hunch-
back-spezifischen Phänotypen. Erst bei genauer Analyse der Sequenzierungen der
als Matrizen für die dsRNA-Synthesen dienenden PCR-Produkte konnte die Konta-
minations-Sequenz als zusätzliches Signal knapp über dem Hintergrundrauschen
nachgewiesen werden. Das detektierte Fragment trug einen 120 bp-Abschnitt der
hunchback-kodierenden Sequenz, der keinem der veröffentlichten oder in unserem
Labor bekannten Tribolium-hb-Klone entsprach, und somit keine Kontamination aus
unserem Labor darstellt. Außerdem kann eine Kreuzkontamination mit Fragmenten
innerhalb des Pilotscreens ausgeschlossen werden, da das besagte Fragment nicht
auf dem für die cDNA-Bank verwendeten Vektor basiert und hunchback nicht als
Positiv-Kontrolle verwendet wurde.
Vermutlich ist die Kontamination auf eine Verunreinigung des verwendeten
cDNA-Bank-Phagen-Lysats mit einer sehr geringen Konzentration des unbekannten
hb-Fragments zurückzuführen. Bei der Prozessierung der zufälligen Auswahl der
Phagen-Klone wurde dann wahrscheinlich die in einem kleinen Teil der Proben
enthaltenen DNA-Verunreinigung mitamplifiziert. Für diese Erklärung spricht, dass
die cDNA-Bank Anfang der 90er Jahre im Rahmen von Arbeiten zu Tribolium-
hunchback von Schröder hergestellt wurde (Wolff et al., 1995).
Diese Befunde zeigen, dass durch die Verwendung von Amplifikationsschritten
und wegen der effizienten RNAi-Maschinerie in Tribolium schon kleine Verunreini-
gungen zu unerwünschten Effekten führen können, und somit die Qualitätskontrolle
der dsRNA-herstellung besondere Aufmerksamkeit verdient.
Sind die zu injizierenden ds-RNAs in der notwendigen Qualität vorhanden, sind
auch bei der Durchführung der Screen-Arbeit einige übergeordnete Themen zu
beachten. Zunächst ist es für das Gelingen des Screens und die Validität der erhal-
tenen Ergebnisse sehr wichtig, dass die Ergebnisse der einzelnen Screener absolut
vergleichbar sind. Hierzu muss sicher gestellt sein, dass einerseits alle Screener
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