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II. 4. Material und Methoden
injizieren (angenommenes L5- und L6-Stadium). Möglicherweise könnte durch Ver-
wendung eines 650 !m-Siebs die Trennung von L5 und L6 noch verbessert werden.
4.2.1).
(H) Die Larven werden nach Geschlecht sortiert (Y-chromosomaler Marker, s.
3) Injektion (Tag 0)
Injektion von 20 Larven (P) bzw. 10 weiblichen Larven (H) pro Gen. Die Larven
werden in einer Petrischale auf Eis kryoanästhesiert. Je 5 werden mit einem feuchten
Pinsel in eine kalte Metallinjektionsplatte (gefräste Vertiefungen für die Larven; auf
einem kaltem Alublock, siehe Anhang) überführt, injiziert und das pro Gen zweimal
wiederholt. Injiziert wird in der Regel lateroventral zwischen das fünfte und sechste
Abdominalsegment, was nicht immer möglich ist. Als Orientierung für die richtige
Lumenweite der Kapillarspitze dient der Übergang vom distalen, dunklen zum proxi-
malen hellen Bereich der Beinkrallen der L6-Larve.
Es wird injiziert bis die Larve vollständig gestreckt ist. Nach der Injektion werden
die Larven in eine Glaspetrischale auf RT überführt wo sie während der Injektion der
nächsten dsRNA trocknen. Es werden wie in Schritt 3) bei 4.2.2 drei Nadelhalter
verwendet und ebenso mit drei Metall-Injektionsplatten verfahren.
! Besonderheiten beim Verlauf der Injektion festhalten.
4) Analyse der pupalen Morphologie und Verpaarung (Tag 11)
Die Tiere werden abgesiebt und in einen Inspektionsblock (1,5 cm Höhe) über-
führt (zweimaliges Umschütten nötig, wegen der Orientierung!). Die Auswertung
erfolgt an einem Fluoreszenz-Stereomikroskop. Die Tiere werden zunächst nach
Geschlecht getrennt, und die Weibchen von ventral und dorsal auf Auffälligkeiten
untersucht. Beides in Auf- oder Durchlicht und im UV-Licht unter Verwendung eines
GFP-Filters. Es empfiehlt sich die zu untersuchenden Tiere aufzureihen und einem
stereotypen Vorgehen zu folgen (von posterior nach anterior etc.).
(H) Die zu screenenden morphologischen Aspekte sollen zur Orientierung der
Screener auf einer „Screening-Tafel“ zusammengefasst sein.
! Festhalten der Anzahl toter Larven
! Festhalten und Dokumentation von Defekten der Metamorphosekontrolle
! Festhalten und Dokumentation morphologischer Defekte
! Festhalten und Dokumentation von Defekten der thorakalen Muskulatur
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