Descargar PDF (20.6Mb) - SEOC

INGENERIA GENÉTICA APLICADA A LA PRODUCCIÓN DE PEQUEÑOS RUMIANTES i 7
luar el nivel de expresión. De esta forma al incluir alguna
de estas células en el blastocito se sabe que de
formar quimeras que afecten a la línea germinal, la
siguiente generación será transgénica.
La metodología utilizada para la inyección de las
células consiste en su aislamiento de cultivo, a continuación
se colocan en una aguja de inyección y, con la
ayuda de ésta, se expelen en el blastocele de un blastocisto.
Hay que dirigir la inyección hacia la masa celular
interna con la esperanza de que alguna de las
células logre asentarse allí y dé lugar a toda o parte
.de una línea germinal. Sólo si las células germinales
están afectadas se producirá un auténtico transgénico
en la segunda generación.
Este método se ha aplicado con éxito en ratones
(41), pero en el resto de las especies animales es necesario
el poder obtener líneas celulares totipotentes.
Otros investigadores (30) han intentado conseguir
quimeras con fibroblastos de cerdo, pero hasta la fecha
no se ha publicado ningún trabajo de este tipo
centrado en pequeños rumiantes.
Utilización de vectores
El planteamiento es muy similar al de la metodología
de recombinación del ADN ya expuesta, en este
caso se busca un sistema de transporte de los genes
al interior del embrión en lugar del interior de la bacteria.
a) Agentes virales
La infección viral se ha utilizado repetidamente y
con diversos fines para introducir ácidos nucleicos en
cultivos celulares, y de la misma forma se pudo comprobar
que la infección de embriones de ratón en estadio
de cuatro-ocho células producía un individuo con
una copia del virus en cada una de sus células (16).
La Biología Molecular ha prestado las herramientas
necesarias para poder manipular los virus, de tal forma
que pueda eliminarse parte de su material genético,
específicamente el causante de los efectos eitopáticos,
y poner en su lugar un transgén de interés. Esta
metodología cuenta con una serie de ventajas dignas
de mención, se produce una integración muy eficiente
de copias simples e intactas del gen, aunque no deja
de ser una infección transmisible con los peligros que
ello conlleva.
La utilización de retrovirus es sin duda la modalidad
más extendida, pero éstos tienen otro factor limitante,
y es el tamaño del fragmento de material genético
que puede adaptarse a la estructura viral. El límite
máximo está en las 8 kilobases, lo que es un gen
de pequeño tamaño si hablamos de individuos eucariotas
(34).
No cabe duda de que se trata de un terreno muy
prometedor, más teniendo en cuenta que las inserciones
virales parecen no producirse tan al azar como
las de otras técnicas. En la actualidad muchos esfuer-
Fig. 5.—Utilización de los espermatozoides como vectores de
fragmentos de ADN para la producción de animales transgénicos.
zos se encaminan a lograr vectores víricos que se
inactiven en el momento en que hayan colocado el
transgén en el genoma de la célula hospedadora, con
lo que el peligro de infección viral desaparecería.
b) Espermatozoides
En 1989 se dieron a conocer los resultados de un
grupo de investigadores (21) que habían logrado introducir
material genético extraño en oocitos de ratón,
utilizando para ello espermatozoides como vectores.
Sus resultados igualaron los de la técnica de microinyección,
que es la de mayor porcentaje de éxito
hasta el momento (fig. 5).
Básicamente la metodología consiste en la incubación
de espermatozoides en un medio de capacitación
al que se añade en la útlima media hora una solución
de ADN, de tal forma que las células espermáticas
captan el ácido nucleico justo antes de ser enfrentadas
con los oocitos durante un proceso de fertilización
in vitro típico. No se han producido nuevas aportaciones
con este planteamiento, pero de confirmarse los
resultados, no cabe la menor duda de que sería un
método ideal, ya que exige una infraestructura mucho
menor que cualquiera de los otros sistemas disponibles
hasta la fecha.
Microinyección de ADN en pronúcleos y núcleos
El único método que, hasta hoy, ha permitido obtener
ovino transgénico consiste en la microinyección
del material genético directamente en uno de los pronúcleos
de'un zigoto o en ambos núcleos de un embrión
de dos células (figs. 6 y 7).
La microinyección de células eucariotas se describió
en 1973 (8) y dos años después se aplicó con éxito
en oocitos de rana (6). En embriones de mamífero se
utilizó por primera vez en 1980 (12) y en 1985 se consiguieron
los primeros cerdos, conejos y ovejas transgénicos
(13).