82 XV JORNADAS CIENTÍFICAS DE LA S.E.O.C. 1 i % Hotilidad indiui dual 00 I 90 • a i i i a a ai 80 7L ^. X 70 rr&r lilis 60 50 II'HI i iiiiiil 40 . i'i'i'i'i' ¡i¡iii¡iji 30 |!¡Í!;!: 20 i'i'i'l'i' 1 10 l¡¡i¡j¡¡!' ílííil, I Etapa 1 Ctapa 2 Etapa 3 ap 0.1; map o.oí; assKp o. ool T 1 Nl^jii Effl • x~ Coi teal Ritar y Salaron asa i!ilililí! ii ii i IIII i itii i 11 ii ¡ LLtU Etapa 4 Etapa 5 T !¡!¡¡¡!¡! ¡di t ii ii i I¡I¡I¡I¡[ !
EFECTO DEL MÉTODO DE CONGELACIÓN SOBRE LA CALIDAD IN VITRO DEL SEMEN... 83 Tabla I Estudio de las mínimas diferencias significativas entre las etapas de cada método de congelación según los tres parámetros estudiados. Distintas letras indican valores estadísticamente diferentes flítodo de Corteel flétodo da -Ritar y Salaraon ñotilidad Acrosoaías Endósaosis (lotüidad Acrosonías Endosóosis Etapa 1 A,C A A A A A Etapa 2 B A 6 A,B B A Etapa 3 A A A B C A Etapa 4 C B A B C B Etapa 5 pone una pérdida de viabilidad. Comparando los resultados de la primera dilución (etapa 1) y la pre-refrigeración (etapa 3) no existen diferencias significativas en ninguno de los tres parámetros estudiados. La solución de lavado utilizada en el método B, sin embargo, sí sjrpone un efecto perjudicial, al menos en cuanto a motilidad y acrosomas normales. La refrigeración, sin embargo, no supone una disminución de la viabilidad con el diluyente a base de yema de huevo. Comparando los resultados obtenidos al final del período de equilibración, justo antes de la congelación (etapa 4), en el método B, se puede observar que los acrosomas y la motilidad mantienen valores semejantes a los de la etapa 3, es decir, antes de comenzar la refrigeración. El diluyente a base de leche descremada (método A), en cambio, no es capaz de aportar una acción protectora de la misma calidad, y por ello hay una disminución significativa de la motilidad y de los acrosomas normales. El semen de macho cabrío es muy sensible al choque frío (8) y la yema de huevo es un gran sistema de protección durante la refrigeración, posiblemente por esa razón el método B permite que los espermatozoides estén en mejores condiciones antes de la congelación. Los datos obtenidos a partir de la prueba de endósmosis resultan difíciles de valorar. Una posible explicación de la bajada en la capacidad de reacción durante la etapa 2 con el método de CORTEEL es que la solución de lavado utilizada en esta técnica es hipoosmótica de por sí, con lo cual la diferencia entre ésta y la solución de endósmosis es menor y la endósmosis posiblemente tenga lugar más rápidamente. De confirmarse este hecho, al cabo de treinta minutos, que es el tiempo establecido en nuestro protocolo, numerosos espermatozoides ya habrían roto su membrana, apareciendo al microscopio como si no hubieran reaccionado. Esta característica de la solución de lavado explica B C B C D B también por qué hay una bajada significativa de la motilidad en esta etapa 2 del método A. Los espermatozoides reaccionan a una baja presión osmótica captando agua, al ser la membrana plasmática inelástica; con el aumento de volumen intracelular, se produce un impedimento físico para el funcionamiento normal del flagelo, lo que da lugar a una motilidad inferior y de peor calidad. Por último, es de destacar el comportamiento en la prueba de endósmosis de los espermatozoides refrigerados por la técnica 2. Hay una diferencia muy significativa en la capacidad de reacción desde la prerrefrigeración (etapa 3) a la precongelación, que puede ser debida a varias causas; la primera es que efectivamente con esta técnica se producen muchas lesiones de la membrana plasmática. Sin embargo, los altos valores de motilidad y acrosomas íntegros no parecen coincidir con esta posibilidad. Otra explicación podría ser que la prueba de endósmosis realizada antes de la congelación, y puesta a punto para esperma recién recogido, no sea la adecuada para células que ya han sufrido un período de equilibración con crioprotectores penetrantes (glicerol) y no penetrantes (yema de huevo), que de alguna manera hayan podido alterar la difusión del agua a través de la membrana. Es más plausible que el efecto sea debido al recubrimiento que del espermatozoide hacen las proteínas de la yema de huevo, porque el glicerol está presente tanto en el diluyente de RITAR y SALAMON como en el de CORTEEL, y en este último en un porcentaje mayor. CONCLUSIONES Según nuestros datos, parece más aconsejable utilizar la técnica de CORTEEL para la congelación de semen de macho cabrío de raza Verata. Esta confiere una buena protección durante la fase de lavado y también en el proceso de congelación propiamente dicho. Sin embargo, el diluyente de CORTEEL no aporta condiciones óptimas durante la refrigeración, siendo mejor el descrito por RITAR y SALAMON. Es muy posible que este defecto en la primera técnica pueda ser paliado añadiendo al diluyente de leche descremada alguna proteína de mejor acción crioprotectora. BIBLIOGRAFÍA 1. CORTEEL, J. M.: «Viabilité des spermatozoides de bous conserves et congeles avec ou sans leur plasma seminal: effet du glucose». Ann. Biol. Anim. Biophys., 14: 741-745, 1974. 2. CORTEEL, J. M.; BARIL, G.; LEBOEUF, B., y NUNES, J. E: «Goat semen technology». En The male in Farm Animal Reproduction, editado por M. Courot, Martinus Nijhoff, La Haya, 1984. 3. CORTEEL, J. M., y PAQUINON, M.: «Preservation of the male gamete (Ram, Buck, Boar)». X Congreso Internacional de Reproducción Animal e Inseminación Artificial Urbana, vol. II: 20-27,1984.