Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung

Ergebnisse Seite 87
3.1.9 Einfluß des Aspartat- Proteinase - Inhibitiors Pepstatin A auf die Kinetik der
Antigenprozessierung
Abb. 20 Einfluß von Pepstatin A auf die Kinetik der Antigenprozessierung
KM-Zellen wurden für 11 Tage in der Gegenwart von M-CSF kultiviert. An Tag 10 wurden die Zellen
in einer Dichte von 1x10 6 Zellen/ml in 24 Well-Platten umgesetzt. Die Stimulation mit LPS bzw. γ-
INF erfolgte von Tag 8 an und wurde bis zur Zellsolubilisierung durchgeführt. Zusätzlich wurden die
Zellen vor Versuchsablauf für 20h mit 10µg/ml Pepstatin A vorinkubiert. Die Antigenzugabe von
25µg FITC-OVA erfolgte für die angegebene Zeitdauer. Nach Ablauf der Inkubationszeiten wurde
die Zellsolubilisierung in den Platten durchgeführt. Die Solubilisate wurden in der SDS-PAGE
aufgetrennt und anschließend auf eine PVDF-Membran geblottet. Der Nachweis der Fragmente
erfolgte durch Fluoreszenzaktivierung, die Signale wurden mit einer CCD-Kamera aufgezeichnet.
Die Blots wurden densitometrisch ausgewertet. Es wurden für jede Bande 4080 Pixel (0,1 inch 2 )
vermessen und der durchschnittliche Grauwert gegenüber der Zeit aufgetragen. Auf der Abzisse ist
die Inkubationsdauer, auf der Ordinate der mittlere Grauwert der Banden mit einem
Molekulargewicht von 50 kD (blau), 40 kD (pink) und 30 kD (grün) aufgetragen.
A=unstimulierte M∅; B= LPS – Stimulation für 72h,1µg/ml; C= Stimulation mit 20U rrγ-IFN für 72h