Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung

Ergebnisse Seite 99
Die N – terminale Aminosäuresequenz der Bande mit einem Molekulargewicht von 40 kD
konnte mittels einer Edmann – Poolsequenzierung bestimmt werden. Es konnten für
neun Positionen Aminosäuren bestimmt werden, jedoch nicht für die erste Position. An
der Position zwei konnten sechs Aminosäuren einwandfrei identifiziert werden, an der
Position vier konnten fünf bestimmt werden. Ab der Position sechs konnten maximal
drei Aminosäuren bestimmt werden. In der Tab. 13 sind die sequenzierten Aminosäuren
wiedergegeben.
Abb. 24 Sequenziermembran der in vivo Prozessierung von FITC-OVA
KM-Zellen wurden für 11 Tage in der Gegenwart von M-CSF kultiviert. An Tag 10 wurden die
ZellenineinerDichtevon1x10 6 Zellen/ml in 24 Well-Platten umgesetzt. Die Antigenzugabe
von 25µg FITC-OVA pro Well erfolgte für 4h. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde die
Zellsolubilisierung in den Platten durchgeführt. Die Solubilisate 2,4x10 7 KMM∅ wurden
vereinigt und aufkonzentriert. Das Solubilisat wurden in der SDS-PAGE aufgetrennt und
anschließend auf eine PVDF-Sequenziermembran geblottet. Der Nachweis der Fragmente
erfolgte durch Fluoreszenzaktivierung, die Signale wurden mit einer CCD-Kamera
aufgezeichnet. 1: 250µl Solubilisat, 2: 500µl Solubilisat, 3: 750 µl Solubilisat
Position Aminosäure
1
2 LYS, VAL, GLN, ARG, ASN, PRO
3 VAL,LEU,PHE
4 ALA, TYR, LYS, SER, GLN
5 GLU, ASP, LEU, ILE
6 LEU, PHE
7 LEU,ALA,GLY
8 LYS, ILE
9 ASN, HIS
10 TYR
Tab. 13Poolsequenzierung der 40 kD – Bande