Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung

Ergebnisse Seite 72
Abb. 12 Vergleich Fluoreszenz und Chemiluminiszenz
A: Direkter Nachweis von FITC-OVA durch Fluoreszenzaktivierung bei 302
nm und Aufnahme der Lichtemmission mit einer CCD-Kamera.
B: Nachweis mittels einer Chemiluminiszenzreaktion, die durch einen direkt
gegen FITC gerichten Mouse – anti FITC Antikörper vermittelt wird.
Es wurde eine 1:10 Verdünnungsreihe von 4 µg FITC-OVA (Spur 1 bzw. 1´)
bis 0,4 pg (Spur 8 bzw. 8´) angesetzt.
die schärferen Nachweise, da die Chemilumineszenz zu Überstrahlungen neigt. Dagegen
ist die Fluoreszenz jedoch erheblich empfindlicher gegenüber Verschmutzungen wie z.B.
durch Staub, was sich als nachteilig für die Dokumentation erwies. Beide Systeme sind
mit dem DIG- System[121] vergleichbar, verfügen aber über ein deutlich besseres Sig-
nal- zu Hintergrund- Verhältnis. Mit der Markierung von OVA mit Fluorescein (FITC-
OVA) konnten die Zellversuche durchgeführt werden, da sich Degradierungsfragmente
empfindlich nachweisen lassen. Besonders der direkte Nachweis war hierfür sehr gut
geeignet, da es zu keinerlei Kreuzreaktivitäten der gegen FITC gerichteten Antikörper mit
zelleigenen Proteinen kommen konnte.
Das markierte Material hat ein Molekulargewicht von 50 kD gegenüber 45 kD des Aus-
gangsmaterial. Da die gekoppelte FITC – Gruppe ein Molekulargewicht von ca. 0,5 kD
hat, trägt das Ovalbumin demnach ca. zehn FITC- Gruppen pro Molekül.