Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung

Material und Methoden Seite 53
ad 100 ml DEPC-H2O
• NP40-Lyse 450 µl NP40-Lyse- Stammlösung
0,45 µl DEPC/EtOH
Die Isolierung der Gesamt – RNA aus eukaryontischen Zellen wurde in Anlehnung an die
Methode von Chomczynski und Sacchi [105] durchgeführt.
Alle Arbeitsschritte wurden soweit möglich auf Eis durchgeführt. Zudem wurden nur au-
toklavierte, sterile Plastikwaren benutzt. Zu den schockgefrorenen Zellen wurden 450 µl
NP40 – Lyse gegeben und gut resuspendiert. Anschließend wurde bei Raumtemperatur
für zwei Minuten bei 14.000 U/min scharf abzentrifugiert. Der Überstand wurde vor-
sichtig abgenommen und in ein neues Eppendorf – Gefäß überführt. Hierzu wurden 450
µl GSCN/ME – Lösung gegeben und für zwei Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Aufgrund der reduzierenden Wirkung von 2-Mercaptoethanol und der denaturierenden
Wirkung von GSCN wurden endogene RNasen inaktiviert. Nach Zugabe von 90 µl drei-
molarer Natriumacetatlösung und 1 ml Phenol / Chloroformlösung wurde die Mischung
gut gevortext. Nach einer dreissigminütigen Zentrifugation bei 14.000 U/min und 4°C
bildeten sich drei Phasen aus. Die obere enthielt die RNA, die mittlere die Interphase mit
der genomischen DNA und die untere Phase die Proteinen. Die obere, RNA - haltige
Phase wurde vorsichtig abgenommen und in ein neues Gefäß überführt und mit einem
Volumen Chloroform gewaschen. Nach einer zehnminütigen Zentrifugation bei 14.000
U/min und 4°C wurde die obere Phase wiederum in ein neues Gefäß überführt und ein
Volumen Isopropanol zur Fällung hinzugegeben. Nach einer mindestens dreissigminüti-
gen Inkubation bei –70°C wurde die Probe für zwanzig Minuten bei 14.000 und 4°C ab-
zentrifugiert. Das Isopropanol wurde abgenommen und durch 1,5 ml kaltes 70%iges E-
thanol ersetzt. Im Anschluß an eine zehnminütige Zentrifugation (14.000, 4°C) wurde
das Ethanol abgezogen und das Pellet luftgetrocknet. Nach dem das Pellet gut getrock-
net war, wurde es in 30 µl Aqua bidest. gelöst. Die RNA wurde bis zum weiteren
Gebrauch bei –70°C gelagert.
2.7.1.3 Photometrische Mengenbestimmung
• Photometer Lambda 2 UV/VIS Spektrometer (Perkin Elmer)
• Quarz Mikroküvetten
Ein Aliquot der RNA – Probe wurde mit DEPC – H2O versetzt und im Photometer bei
260nm gemessen. Als Richtwert zur Ermittlung der RNA – Menge gilt: eine optische