Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung

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rungen kam. Ebenso konnte die thermische Stabilität des gereinigten OVA nachgewiesen
werden, eine 24h Inkubation in Acetatpuffer bei pH 4,6 und 37°C führte zu keinen
nachweisbaren Abbauprodukten (Daten nicht gezeigt). Aufgrund der hohen Reinheit
nach der Anionentauscherchromatographie konnte auf nachfolgende Reinigungsschritte
verzichtet werden. Das gereinigte OVA verfügte über eine genügende Reinheit für die
nachfolgenden Testsysteme. Die verschieden Eluate wurden für weitere Versuche ge-
poolt, in Phosphatpuffer umdialysiert und in Aliquoten zu je 10 mg/ml bei –20°C gela-
gert.
3.1.2 Markierung und Nachweis von Ovalbumin
Für die in vivo Untersuchungen war es notwendig, dass Protein zu markieren. Im Rah-
men meiner Diplomarbeit wurde als Markierungsreagens bereits Digoxigenin erfolgreich
eingesetzt [121]. Dieses Reagens hat aber zwei gravierende Nachteile. Zum einen ist das
Digoxigenin toxisch, so dass bei der Handhabung zahlreiche Sicherheitsvorkehrungen
zu treffen sind. Zum anderen zeigt der Nachweis ein schlechtes Signal zu Hintergrund -
Verhältnis, so dass die Nachweisgrenze bei ca. 500 pg lag. Als Alternative bot sich die
Markierung mit dem Fluoreszenz – Farbstoff Fluorescein an. Auch dieses Molekül ist als
NHS - Ester zu beziehen, so dass es über den gleichen Mechanismus wie die Digoxige-
nin- Gruppe an das Protein gekoppelt werden konnte. Das markierte Molekül konnte auf
zwei Arten nachgewiesen werden: Über eine Chemilumineszenz – Reaktion, bei der ein
mit Peroxidase gekoppelter anti-FITC – Antikörper ein spezifisches Substrat umsetzt.
Dies führt zu einer Chemilumineszenz in Form einer kalten Lichtemission. Die Signale
konnten über einen Röntgenfilm detektiert werden. Bei der direkten Methode wurde die
chromophore Gruppe FITC durch UV-Licht angeregt. Die Fluoreszenz - Emission wurde
mittels einer CCD – Kamera aufgenommen.
Wie die Abb. 12 zeigt, besteht hinsichtlich der Nachweisgrenze kein Unterschied zwi-
schen dem direktem Nachweis durch Fluoreszenz und dem indirekten Nachweis mittels
Chemilumineszenz. Hierbei wurde bei beiden Systemen lange exponiert, um die
maximale Nachweisgrenze zu ermitteln. Mit beiden Systemen können Proteine bis in den
unteren Picogrammbereich nachgewiesen werden. Insgesamt zeigt jedoch die
Fluoreszenz die schärferen Nachweise, da die Chemilumineszenz zu Überstrahlungen