Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung

Ergebnisse Seite 89
3.1.10 Kinetikanalyse der Antigenprozessierung unter dem Einfluß des SH-
Abb. 21 Kinetik der Antigenprozessierung in der Gegenwart von Leupeptin
KM-Zellen wurden für 11 Tage in der Gegenwart von M-CSF kultiviert. An Tag 10 wurden die Zellen
in einer Dichte von 1x10 6 Zellen/ml in 24 Well-Platten umgesetzt. Die Stimulation mit LPS bzw. γ-INF
erfolgte von Tag 8 an und wurde bis zur Zellsolubilisierung durchgeführt. Zusätzlich wurden die Zellen
vor Versuchsablauf für 20h mit 20µg/ml Leupeptin vorinkubiert. Die Antigenzugabe von 25µg FITC-
OVA erfolgte für die angegebene Zeitdauer. Nach Ablauf der Inkubationszeiten wurde die
Zellsolubilisierung in den Platten durchgeführt. Die Solubilisate wurden in der SDS-PAGE aufgetrennt
und anschließend auf eine PVDF-Membran geblottet. Der Nachweis der Fragmente erfolgte durch
Fluoreszenzaktivierung, die Signale wurden mit einer CCD-Kamera aufgezeichnet. Die Blots wurden
densitometrisch ausgewertet. Es wurden für jede Bande 4080 Pixel (0,1 inch 2 ) vermessen und der
durchschnittliche Grauwert gegenüber der Zeit aufgetragen. Auf der Abzisse ist die Inkubationsdauer,
auf der Ordinate der mittlere Grauwert der Banden mit einem Molekulargewicht von 50 kD (blau), 40
kD (pink) und 30 kD (grün) aufgetragen.
A=unstimulierte M∅; B= LPS – Stimulation für 72h,1µg/ml; C= Stimulation mit 20U rrγ-IFN für 72h