Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung

Ergebnisse Seite 93
Abb. 22 Einfluß verschiedener Proteinaseinhibitoren auf die
Antigenprozessierung durch KMM∅
KM-Zellen wurden für 11 Tage in der Gegenwart von M-CSF kultiviert. An Tag 10 wurden die
Zellen in einer Dichte von 1x10 6 Zellen/ml in 24 Well-Platten umgesetzt. Die Stimulation mit LPS
bzw. γ-INF erfolgte von Tag 8 an und wurde bis zur Zellsolubilisierung durchgeführt. Zusätzlich
wurden die Zellen vor Versuchsablauf für 20h mit den angegeben Inhibitoren vorinkubiert. Die
Antigenzugabe von 25µg FITC-OVA erfolgte für 4h. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde die
Zellsolubilisierung in den Platten durchgeführt. Die Solubilisate wurden in der SDS-PAGE
aufgetrennt und anschließend auf eine PVDF-Membran geblottet. Der Nachweis der Fragmente
erfolgte durch Fluoreszenzaktivierung, die Signale wurden mit einer CCD-Kamera aufgezeichnet.
A=unstimulierte M∅; B= LPS – Stimulation für 72h,1µg/ml; C= Stimulation mit 20U rrγ-IFN für
72h
1=200µg/ml E-64, 2=100µg/ml E-64, 3=30µg/ml E-64, 4=100µg/ml Pepstatin A, 5= 20 µg/ml
Pepstatin A,6=400µg/ml Leupeptin,7=20µg/ml Leupeptin,8=5µg/ml CAT3,9=1µg/ml CAT3,
10=0 7µg/ml CAT3