Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung

Material und Methoden Seite 51
Nach dem Pipettieren der Ansätze wurde für drei Stunden bei 37°C inkubiert. Die Reak-
tion wurde Zugabe von 40 µl – Laemmli - Puffer gestoppt und die Proben gelelektropho-
retisch aufgetrennt. Der Nachweis der proteolytischen Fragmente erfolgte durch Chemi-
luminiszenz - Detektion bzw. Fluoreszenz nach dem Transfer der Fragmente auf PVDF -
Membran.
2.6 Durchführung der intrazellulären Prozessierung von
markierten Antigenen
Die für den Versuch eingesetzten dendritischen Zellen wurden aus GM-CSF - supple-
mentierten Knochenmarkskulturen gewonnen. Die Zellen wurden für acht Tage in einer
Dichte von 5x10 5 Zellen/ml Kulturmedium (DMEM, 5% FCS, 1% Gln, 2 ng rmGM-CSF)
in Petrischalen kultiviert, die Zellernte erfolgte mit Versen. Knochenmarksmakrophagen
wurden durch elftägige Kultur von Knochenmarkszellen in Gegenwart von M-CSF ge-
wonnen. Die Zellen wurden in einer Dichte von 5x10 5 Zellen/ml Kulturmedium (DMEM,
50% L929-Überstand, 5% FCS, 10% HS, 1% Gln) für elf Tage kultiviert und anschlie-
ßend mit Versen geerntet. Die Knochenmarksmakrophagen wurden 72h vor Versuch-
sende mit LPS bzw. γ- Interferon stimuliert. Die Zugabe von Proteinaseinhibitoren erfolg-
te 20h vor Versuchsende.
Kontrolle Prot. + B Prot. + D Prot. + BD
Protein 1 µl 1 µl 1 µl 1 µl
Kathepsin B — 1 µl — 1 µl
Kathepsin D — — 1 µl 1 µl
DTT 1 µl 1 µl 1 µl 1 µl
Puffer 38µl 37µl 37µl 36µl
Tab. 8 Pipettierschema des In Vitro Verdau
markierter Proteine
Die Zellen wurden einem Tag vor der Antigenzugabe in einer Dichte von 5x10 5 Zellen/ml
Kulturmedium bei DC´s bzw. 1x10 6 Zellen/ml Kulturmedium nach zweimaligem Wa-
schen in 24-Well-Kulturplatten eingesetzt. Die Zugabe des markierten Antigens erfolgte
in einer Konzentration von 25 µg/ml Kulturmedium über einen Zeitraum von 5min bis
zu 4h. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden die 24 Well- Platten bei 1200 U/min für
15 min. abzentrifugiert und zweimal mit PBS gewaschen. Nach sorgfältigem Entfernens
des PBS wurde zu den Zellen die entsprechende Solubilisierungslösung gegeben. Nach
einer mindestens halbstündigen Inkubation konnten die Zellen bis zur weiteren Verar-
beitung bei -20°C gelagert werden.