Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung
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Material und Methoden Seite 39<br />
darauf geachtet werden mußte, das die einzelnen Schichten luftblasenfrei übereinan<strong>der</strong><br />
lagen.<br />
Die Blothalterung wurde anschließend zugeklappt und mit <strong>der</strong> Klammer verschlossen.<br />
Der so vorbereitete Blot sowie die Kühlschlange wurden in die Transferkammer einge-<br />
hängt. Die komplett zusammengesetzte Blotkammer wurde dann an das Netzteil und<br />
das Kühlaggregat, eingestellt auf 4°C, angeschlossen. Während des Blotvorgangs wurde<br />
<strong>der</strong> Transferpuffer mittels eines Magnetrührers verwirbelt, um die Abwärme besser zu<br />
verteilen.<br />
Es wurde bei einer Stromspannung von 200 V für eine Stunde unter ständiger Kühlung<br />
geblottet [100]. Nach dem Blotvorgang wurde die PVDF- Membran zwe<strong>im</strong>al kurz mit TBS<br />
gewaschen.<br />
2.3.7 Nachweis <strong>der</strong> an PVDF-Membran gebundenen <strong>Protein</strong>e<br />
• Färbelösung 0,25% Coomassie Blue R-250; 50% Methanol; 10 % Essigsäure<br />
• Entfärbelösung 5% Methanol; 7,5% Essigsäure<br />
Um die Effizienz des <strong>Protein</strong>transfers o<strong>der</strong> Banden für Sequenzierungen zu visualisieren,<br />
können die auf <strong>der</strong> Membran gebundenen <strong>Protein</strong>e mit Coomassie Blue angefärbt wer-<br />
den. Nach Beendigung des Transfers wurde die Membran zwe<strong>im</strong>al in TBS gewaschen.<br />
Anschließend wurde die Membran für zwei Stunden in <strong>der</strong> Färbelösung inkubiert. Nach<br />
Beendigung des Färbevorgangs wurde die Färbelösung abgenommen und die Membran<br />
unter mehrfachem Wechsel in <strong>der</strong> Entfärbelösung inkubiert. Der Entfärbevorgang dauer-<br />
te mindestens zwei Stunden, zur vollständigen Entfärbung konnte auch die Membran<br />
auch für 24 h bei 4°C entfärbt werden. Nach <strong>der</strong> Entfärbereaktion wurde die Membran<br />
luftgetrocknet und in Hybridisierungsbeutel eingeschweißt.<br />
2.3.8 Nachweis markierter <strong>Protein</strong>e<br />
Be<strong>im</strong> Nachweis von Fluorescein- o<strong>der</strong> Digoxygenin markierten <strong>Protein</strong>en wurde die spe-<br />
zifische Bindung zwischen Marker und Antikörper ausgenutzt. Die Detektion <strong>der</strong> mar-<br />
kierten <strong>Protein</strong>e erfolgte nach gleichem Prinzip. Be<strong>im</strong> Digoxygenin wurde ein spezifisch<br />
gegen Digoxygenin gerichtes Fab´-Fragment verwendet, an dass das Enzym alkalische<br />
Phosphatase gekoppelt ist, während an das Anti - Fluorescein Fab´-Fragment Peroxidase<br />
gekoppelt ist.
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