Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung
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Ergebnisse Seite 78<br />
RNasen während <strong>der</strong> Isolation zu falschen Ergebnissen führen. Während von unst<strong>im</strong>u-<br />
lierten und γ - Interferon st<strong>im</strong>ulierten Makrophagen ausreichende Mengen an RNA ge-<br />
wonnen wurden, konnte von den LPS – st<strong>im</strong>ulierten Makrophagen nur eine geringe<br />
Menge an RNA gewonnen werden. Die Tab. 11 gibt einen Überblick über die gewonnene<br />
Menge an RNA in Relation zur Zellzahl.<br />
Zellzahl RNA in µg<br />
M∅ 4x10 7<br />
9,4<br />
γ -INFM∅ 3,2x10 7<br />
14<br />
LPS - M∅ 8,8x10 6<br />
1<br />
Tab. 11 Isolierte RNA – Menge in<br />
Relation zur Zellzahl<br />
3.1.5.2 RT – PCR Nachweis lysosomaler <strong>Protein</strong>asen<br />
Für den RT-PCR Nachweis wurden je 1µg RNA mittels des ThermoScript – Systems in<br />
cDNA umgeschrieben. Durch geeignete Pr<strong>im</strong>er konnten nun <strong>Protein</strong>asen gezielt auf<br />
mRNA – Ebene nachgewiesen werden. Für die Beteiligung an <strong>der</strong> <strong>Prozessierung</strong> <strong>im</strong> endo-<br />
/ lysosomalen System sind unter an<strong>der</strong>en die SH – <strong>Protein</strong>asen Kathepsin B, L, S, H<br />
[123], die erst kürzlich entdeckte <strong>Protein</strong>ase Legumain [124] sowie die sauren<br />
<strong>Protein</strong>asen Kathepsin D und E [123] beschrieben worden. Auf diese <strong>Protein</strong>asen wurde<br />
in allen drei Aktivierungsstadien mittels PCR <strong>der</strong> Nachweis geführt. Um zu prüfen, ob<br />
Test bp Forward – Pr<strong>im</strong>er Reverse-Pr<strong>im</strong>er unst<strong>im</strong>ulierte<br />
M∅∅∅∅<br />
Aktin 500 5´ GTG GGC CGC TCT<br />
AGG CAC CA 3´<br />
Kathepsin B 969 5´ GTC CTT GAT CCC<br />
TCT CTC TTG 3´<br />
Kathepsin H 336 5´ ATC CGC AAG TGA<br />
GGT AAA TAA 3´<br />
Kathepsin L 984 5` GGC TGT CCT CTG<br />
CTT GGG AAC 3´<br />
Kathepsin S 1009 5´ GCA ATA GCT AGC<br />
AAT CCC GCA 3´<br />
Legumain 840 5´ GAT GGA GGC AAG<br />
CAC TGG GTG 3´<br />
Kathepsin D 438 5´ AAC TAA TGC TTG<br />
GCG GCA CT 3´<br />
Kathepsin E 468 5´ AAC CTT GTG GCT<br />
CTG CCT AT 3´<br />
Tab. 12 RT – PCR Analyse lysosomaler <strong>Protein</strong>asen<br />
γγγγ-Interferon<br />
st<strong>im</strong>ulierte<br />
M∅∅∅∅<br />
LPS –<br />
st<strong>im</strong>ulierte<br />
M∅∅∅∅<br />
5´ TAG CCC TCG TAG<br />
ATG GGC ACA G 3´ + + +<br />
5` GAA TCT TCC CCA<br />
GTA CTG CTG 3´ + + +<br />
5´ CAA GCA GTT GGC<br />
CTG TGC AGC 3` + + +<br />
5´ CAC GAC AGG ATA<br />
GCT GGC CGC 3´ + + +<br />
5´ GTT TTG GGT GCC<br />
CCT GGT GTG 3´ + + +<br />
5´ GGT GAG GTC AAG<br />
GTG TGT GAC 3´ + + +<br />
5´ ACG GTG TAG TAG<br />
CAG CCA AT 3´ + + +<br />
5´ CGG AGG TTG AAT<br />
GTC AAG TC 3´ + + +
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