Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung

Material und Methoden Seite 55
2.7.3 PCR – Methoden
Die Polymerasekettenreaktion (PCR) ist eine in vitro – Technik, mit der man gezielt Nuk-
leinsäureabschnitte, die von zwei bekannten DNA – Sequenzen eingerahmt werden, ver-
vielfältigen kann. Sie wurde von Erlich, Saiki und Mullis für die in vitro – Vermehrung
des β - Globingens etabliert [106]. Um DNA mit Hilfe einer PCR amplifizieren zu können,
benötigt man als Starthilfe Oligonucleotidprimer, sogenannte Amplimer. Dabei handelt
es sich um kurze, einzelsträngige DNA – Moleküle, die komplementär zu den Enden ei-
ner definierten Sequenz der DNA – Matrize (Template) sind. Eine DNA – Polymerase ver-
längert unter den richtigen Reaktionsbedingungen in Gegenwart von Desoxynucleo-
sidtriphosphaten (dNTPs) die Primer entlang der einzelsträngigen DNA – Matrize und
synthetisiert so neue DNA – Stränge, deren Sequenz komplementär zur Matrize ist. All
diese DNA – Moleküle liegen am Ende der Reaktion als Doppelstränge vor. Um diese
Synthese zu wiederholen, muß man die doppelsträngige DNA erneut durch Hitze auf-
schmelzen und nach Abkühlung die Primer wieder binden lassen. Sobald die Primer
hybridisieren und eine optimale Temperatur vorherrscht, verlängert die Polymerase die
Primer. Die Zahl der amplifizierten Moleküle steigt exponentiell nach der Formel 2 n,wo-
bei n die Anzahl der Vermehrungszyklen angibt. Jeder Reaktionszyklus einer PCR be-
steht aus drei typischen Reaktionschritten:
I. Thermische Denaturierung der Matrizen – DNA bei 93°C – 95°C
II. Anlagerung (Anneling) der Oligonukleotidprimer an die einzelsträngige DNA (50 – 65°C)
III. DNA – Synthese ausgehend von den Primern durch eine thermostabile DNA- Polymerase (72°C)
Dieser Reaktionszyklus wird typischerweise 30-40 mal wiederholt und führt zu einer ex-
ponentiellen Vermehrung des durch die Amplimere flankierten DNA – Abschnittes. Der
Nachweis der Amplifikationsprodukte erfolgt durch eine gelelektrophoretische Auftren-
nung eines Aliquotes des PCR – Ansatzes. Bei der Durchführung der PCR ist strengstens
darauf zu achten, dass es zu keinerlei Fremd – DNA Kontamination kommt, da bereits
winzigste Spuren einer Verunreinigung zu falschen Ergebnissen führen kann.
Mit Hilfe der RT-PCR lässt sich die Genexpression auf Stufe der RNA untersuchen. Hier-
bei wird die mRNA mit Hilfe einer Reversen – Transkriptase in cDNA umgeschrieben. Mit
genspezifischen Primer lässt sich so über PCR leicht nachweisen, ob ein bestimmtes
Gen auf mRNA – Ebene exprimiert wird [107].