Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung

Material und Methoden Seite 23
Versen: Zum Ablösen adhärenter Zellen aus Kulturgefäßen diente diese EDTA - haltige,
physiologische Salzlösung (2,6 mM KCl, 136,8 mM NaCl, 10 mM EDTA, 1,1 mM Gluko-
se, 1,4 mM KH2PO4, 8,1mMNaH2PO4 ).
TRP/EDTA - Lsg: Zum Ablösen der F10-Tellen aus Kulturflaschen diente diese EDTA -
haltige, physiologische Lösung (0,25% (w/v) Trypsin, 0,03% (w/v) EDTA ü.N. in PBS ge-
löst, sterilfiltriert). Lagerung bei -20°C.
DMEM: DULBELCCO´S MODIFIED EAGLE´S MEDIUM (9,75 g/l DMEM Trockenpulver, 3,7 g/l
NaHCO3, 10 ml/l Pen/Strep - Lösung, 1 ml/l 2-Mercaptoethanol; pH 7,2) wurde als Ba-
siskulturmedium bei der Kultivierung von dendritischen Zellen und Zellinien eingesetzt.
Das DMEM Trockenpulver enthält Phenolrot als pH - Indikatorfarbstoff.
MEM: MINIMUM ESSENTIAL MEDIUM (9,526 g/l MEM Trockenpulver, 4,77 g HEPES, 10 ml
/ l Pen/Strep -Lösung, 1 ml/l 2-Mercaptoethanol; pH 7,2) wurde als Waschmedium
beim Umsetzen der Zellen verwendet. Das MEM Trockenpulver enthält Phenolrot als pH
-Indikatorfarbstoff.
2.2.2 Seren zur Supplementierung von Medien und Puffern
Um die Vitalität der Zellen zu erhalten, wurden die Kultur- und Waschmedien mit FCS
(fetal calf serum) und zum Teil zusätzlich mit HS (horse serum) supplementiert. Die Se-
ren wurden von den Firmen Roche bzw. Biochrom tiefgefroren, steril und auf My-
koplasmen getestet, bezogen. Zur Komplementinaktivierung erfolgte eine 30 minütige
Inkubation bei 56°C. Vor dem Einsatz in die Zellkultur wurden die Seren auf Toxizität
und auf Eignung für verschiedene Zelltypen getestet.
2.2.3 Kulturbedingungen
Sämtliche Arbeiten wurden in einer sterilen Werkbank unter Verwendung steriler Glas-
und Plastikwaren durchgeführt, um Kontaminationen mit Luftkeimen wie Pilzsporen
und Bakterien zu verhindern. Die Zellkulturen wurden in einem Brutschrank bei 37°C,
ca. 95% Luftfeuchtigkeit und einem Kohlendioxidgehalt von 10% kultiviert. Unter diesen
Bedingungen behalten die Kulturmedien einen physiologischen pH - Wert, und Flüssig-
keitsverluste durch Verdunstung sind minimal.